Prs--Nampt融合蛋白的改造与全细胞催化合成NMN.pdfVIP

浙江大学硕士学位论文致谢

致谢

国有成均，在浙之滨。2018年9月，怀着对浙大校园的憧憬和对研究生生活

的向往，踏入校园至今已有3年余3个月。这段求学时期是我人生中非常重要的

时光，我有幸能够接触到不仅传授我知识学问，而且从更高层次指导我人生与价

值追求的良师，他们使我坚定了人生的方向，获得了追求的动力，留下了研究生

生活的美好回忆。在此，我真诚地向我尊敬的老师们和母校表达我深深的谢意。

昔言求是，实启尔求真。这篇论文是在我的导师金志华老师的亲切关怀和悉

心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，

如“求是，创新”的浙大校训深深地感染和激励着我。在此，谨向金老师致以真

诚的谢意和崇高的敬意。

感谢在研究生学习期间给我上课的老师们，特别是课题组的吴志革老师、金

庆超老师、杨郁老师等。我能够顺利完成我的研究生课题离不开各位老师的支持

和帮助。

感谢我认识的师兄弟、师姐妹、同学们，有幸与你们同窗是我读研的最大收

获。在我挫折时给我鼓励，在我失落时给我支持，与你们同行，使我的人生之路

倍感温暖!

感谢我的父亲、母亲对我的理解、支持和帮助。尽管与他们为我付出的一切

相比，所有的语言都显得苍白无力，我仍要真诚地说声：谢谢!

唯学无际，际于天地。愿各位亲朋好友，师长同学，百尺竿头，更进一步。

张雄雄

2021年12月

浙江大学硕士学位论文摘要

摘要

烟酰胺单核苷酸(NicotiIl吼ide

多，条件要求严格，同时伴有环境污染，且部分关键步骤收率低。而全细胞生物

催化合成因其低成本、低污染、较好的收率等优点成为在环境友好的条件下合成

NMN的一种颇具竞争力的替代途径。本研究利用磷酸核糖焦磷酸合成酶

(Phospho曲osylpyrophosphatesynⅡlase，Prs)和烟酰胺磷酸核糖转移酶

(Nico恤aIllide

通过对Prs-N觚lpt融合蛋白进行定点饱和突变、优化诱导表达条件及反应条件提

高合成NMN的效率。

NaI】叩t的空间结构与参与反应结合位点的氨基酸，选择融合蛋白胛基因上R101、

技术构建突变体，采用荧光法测定产物NMN浓度，筛选得到一株NMN浓度提

升8．3％的突变体E110D。

(2)突变体E110D表达的优化。以异丙基．D．D．硫代半乳糖苷

态，探索以乳糖替代IPTG进行诱导。优化后突变体E1lOD的诱导和培养条件为：

接种1％LB的活化菌液，加入氨苄青霉素至终浓度达100

mg／L，在37。C、200巾m

摇床里培养至菌液OD600=0．6Abs，加入终浓度2

g／L乳糖和2g／L葡萄糖作为诱

h。以此诱导及培养条件为基础，

导剂，在250C、200印m摇床里继续诱导培养24

在5L发酵罐中进行高密度发酵，发酵OD600达到160Abs，得到380

g突变体湿

茵体。

(3)突变体E110D合成№删的优化。以NAM和葡萄糖为反应物经全细

胞催化合成得到NMN，探索出反应的最佳条件为：①NAM的投料时间为突变

体E110D诱导表达18

h时，②NAM终浓度为1．2g／L，③添加终浓度为12g／L

的葡萄糖，④反应pH为7．O，⑤反应温度为30。c。经过6h反应，m删浓度

II

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