牛基因编辑成纤维细胞制备技术规程.docxVIP

ICS65.020.30CCSB43

NXSLX

宁夏饲料工业协会团体标准

T/NXSLX0208—2025

牛基因编辑成纤维细胞制备技术规程

Technicalcodeofgenerationforpreparationofgene-editedbovinefibroblasts

2025-11-7发布2025-12-7实施

宁夏饲料工业协会发布

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T/NXSLX0208—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由宁夏大学提出。

本文件由宁夏饲料工业协会归口。

本文件起草单位：宁夏大学、宁夏农林科学院动物科学研究所、宁夏大北农科技实业有限公司、海原县科学技术局、固原富民农业科技发展有限公司。

本文件主要起草人：魏大为、杨东梅、张久盘、马云、张娟、岳家琪、蔡蓓、宋雅萍、张令锴、胡亚美、聂路玮、姜超、刘源、田平、何学良、咸海龙、焦若普、龚红芳、马艺伦。

T/NXSLX0208—2025

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牛基因编辑成纤维细胞制备技术规程

1.范围

本标准规定了牛基因编辑成纤维细胞制备的术语和定义、基本要求、技术规程、质量控制、记录与档案管理。

本标准适用于以牛为供体，进行耳缘组织来源的成纤维细胞的分离、纯化与鉴定，基因编辑（以CRISPR/Cas9编辑系统为主）及编辑细胞的冻存与复苏的全过程。

2.规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其最新版本适用于本文件（注：本文件中所涉及到的所有技术规程均遵循中华人民共和国生物安全法，且相关动物实验按照GB/T35892标准执行）。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T

35892

实验动物福利伦理审查指南

GB/T

27425

科研实验室良好规范

GB/T

42398

细胞培养洁净室设计技术规范

GB/T

45137

畜禽基因组编辑育种技术规程

GB/T

45136

猪牛羊体细胞克隆技术规范

DB4403/T336DNA合成实验室环境和安全要求

3.术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1牛成纤维细胞BovineFibroblast

牛成纤维细胞是一种来源于牛结缔组织的典型细胞，它不仅具备所有成纤维细胞共有的核心功能（如合成细胞外基质、参与组织修复），更因其作为重要的生物学研究模型和生物技术关键工具（尤其是在克隆和疫苗生产领域）而备受关注。

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3.2牛基因编辑BovineGeneEditing

牛基因编辑是指利用现代分子生物学技术（特别是CRISPR/Cas9等“基因剪刀”技术），对牛的基因组进行精准、定点修改的过程。

4.基本要求

4.1环境与设施

实验室需符合GB19489、GB/T27425、GB/T42398和DB4403/T336中相关要求，具备无菌操作室（超净工作台或生物安全柜）、细胞培养箱（37℃,5%CO?)、倒置相差显微镜、离心机、水浴锅、超低温冰箱（-80℃)及液氮罐等基本设施。应具备独立的功能区：样本接收区、无菌操作区、细胞培养区、基因操作区、储存区。

4.2试剂与耗材

细胞培养基（DMEM/Highglucose）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶消化液、双抗（青霉素、链霉素）、PBS缓冲液、DMSO等应为细胞培养级。

基因编辑相关试剂（Cas9蛋白、gRNA、核转染试剂盒等）应选择高纯度、低内毒素的产品。

5.技术规程

5.1成纤维细胞的分离、纯化与鉴定

5.1.1组织样本采集

按照GB/T24863的规定对牛耳缘组织进行无菌手术采集。

5.1.2组织块法分离成纤维细胞

利用无菌器械剔除牛耳缘组织上的毛发，待PBS清洗3次后剪成约1mm3的小块。将组织块均匀贴附于细胞培养瓶底，间距约0.5-1cm；于细胞培养箱（37℃、5%CO2）倒置培养1h待组织块略干燥后，轻轻加入细胞生长培养基（含10%FBS）继续培养。每天观察细胞迁出情况。

5.1.3消化传代与纯化

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当原代成纤维细胞沿着组织块迁出并铺满瓶底约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代,并通过差速贴壁法进行纯化。

5.1.4细胞鉴定

通过细胞形态学观察（典型的梭形、漩涡状生长）和免疫荧光染色（波形蛋白Vimentin阳性，角蛋白Cytokeratin阴性）进行鉴定。