牛肌内脂肪细胞外泌体分离鉴定技术规程.docxVIP

ICS65.020.30CCSB43

NXSLX

宁夏饲料工业协会团体标准

T/NXSLX0210—2025

牛肌内脂肪细胞外泌体分离鉴定技术规程

Technicalspecificationforisolationandidentificationofbovineintramuscularadipocyteexosomes

2025-11-7发布2025-12-7实施

宁夏饲料工业协会发布

I

T/NXSLX0210—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由宁夏大学提出。

本文件由宁夏饲料工业协会归口。

本文件起草单位：宁夏大学、宁夏农林科学院动物科学研究所、海原县科学技术局、固原富民农业科技发展有限公司、平罗县农业农村局。

本文件主要起草人：魏大为、马艺伦、张久盘、龚红芳、马云、顾自春、张桂杰、宋雅萍、姜超、焦若普、杨东梅、张娟、蔡蓓、张令锴、胡亚美、聂路玮、刘源、田平、何学良、李川霞、咸海龙。

T/NXSLX0210—2025

1

牛肌内脂肪细胞外泌体分离鉴定技术规程

1.范围

本文件规定了牛肌内脂肪细胞外泌体分离鉴定技术的术语和定义、技术要求、卫生与安全要求及数据记录与报告。

本文本适用于牛肌内脂肪细胞外泌体的分离与鉴定。

2.规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其最新版本适用于本文件（注：本文件中所涉及到的所有技术规程均遵循中华人民共和国生物安全法，且相关动物实验按照GB/T35892标准执行）。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T

35892

实验动物福利伦理审查指南

GB/T

37864

生物样本库质量和能力通用要求

GB/T

27425

科研实验室良好规范

GB/T

42398

细胞培养洁净室设计技术规范

GB/T

38477

基因表达的测定蛋白印迹法

3.术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1牛原代肌内脂肪细胞BovinePrimaryIntramuscularAdipocytes

从牛背最长肌或肋间肌中分离并诱导分化的脂肪细胞，具有脂滴积累能力，表达PPARγ、FABP4等脂肪细胞标志物。

3.2无外泌体胎牛血清条件培养基ConditionedMediumwithExosome-DepletedFBS

T/NXSLX0210—2025

2

使用预先去除了外泌体的胎牛血清所配制的细胞培养基（15%的无外泌体FBS+1%的100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素+84%的DMEM培养基）。

4.技术要求

4.1样品采集

依据GB/T35892中有关动物选择与使用的规定，严格筛选试验动物。牛肌内脂肪组织样本的采集、处理、保存与质量控制全过程应严格遵循GB/T37864标准的要求。

4.2细胞分离

细胞实验室的建设、管理与运行应严格遵循GB/T27425与GB/T42398标准的要求。组织样本经PBS清洗3次后剪成约1mm3的小块。将组织块均匀贴附于细胞培养瓶底，间距约0.5-1cm；于细胞培养箱（37℃、5%CO2）倒置培养1h待组织块略干燥后，轻轻加入细胞生长培养基（含10%FBS）继续培养。每天观察细胞迁出情况。

4.3消化传代与纯化

当原代肌内脂肪细胞沿着组织块迁出并铺满瓶底约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代,并通过差速贴壁法进行纯化。

4.4细胞鉴定

通过油红O染色法与BODIPY荧光染色法对牛肌内脂肪细胞中的脂滴含量进行检测。

4.5外泌体收集用细胞培养

4.5.1培养基置换

当细胞融合度达70%时，弃原有培养基，用PBS洗涤细胞2次，更换为15%无外泌体FBS条件培养基后，继续放入37℃、5%CO?培养箱培养48h~72h。

4.5.2上清收集

收集细胞培养液，4℃条件下2000×g离心10min，去除漂浮细胞及大碎片，上清液经0.22μm滤膜过滤，立即用于外泌体分离或-80℃冻存（保存时间小于1周）。

4.6外泌体的分离

T/NXSLX0210—2025

3

采用超速离心法的方式：取出滤液后依次进行500×g离心10min收集上清、10,000×g离心30min去除大颗粒、100,000×g超