牛成肌细胞外泌体分离技术规程.docxVIP

ICS65.020.30CCSB43

NXSLX

宁夏饲料工业协会团体标准

T/NXSLX0209—2025

牛成肌细胞外泌体分离技术规程

TechnicalSpecificationforIsolationofBovineMyoblast-DerivedExosomes

2025-11-7发布2025-12-7实施

宁夏饲料工业协会发布

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由宁夏大学提出。

本文件由宁夏饲料工业协会归口。

本文件起草单位：宁夏大学、宁夏农林科学院动物科学研究所、海原县科学技术局、固原富民农业科技发展有限公司

本文件主要起草人：魏大为、龚红芳、张久盘、马艺伦、宋雅萍、张娟、马云、张桂杰、张令锴、胡亚美、聂路玮、姜超、焦若普、杨东梅、田平、何学亮、咸海龙

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牛成肌细胞外泌体分离技术规程

1.范围

本文件规定了牛成肌细胞来源外泌体的术语和定义、细胞培养与上清收集、分离纯化技术、质量鉴定、卫生与安全要求及档案记录等技术要求。

本文件适用于科研机构、检测机构等牛原代成肌细胞及成肌细胞外泌体的分离、纯化及质量控制相关工作。

2.规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其最新版本适用于本文件（注：本文件中所涉及到的所有技术规程均遵循中华人民共和国生物安全法，且相关动物实验按照GB/T35892标准执行）。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T

35892

实验动物福利伦理审查指南

GB/T

43459

洁净室及受控环境中细胞培养操作技术规范

GB/T

38477

基因表达的测定蛋白印迹法

DB51/T3128畜禽遗传材料收集与保存技术规程

DB51/T2075动物源性样品采集操作规程

3.术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1牛成肌细胞外泌体BovineMyoblast-DerivedExosomes

来源于牛成肌细胞分泌的纳米级囊泡，直径范围30nm~150nm，具有脂质双分子层结构，携带蛋白质、核酸、脂质等生物活性物质，表面表达CD9、CD63、TSG101等特征性标志物。

3.2牛原代成肌细胞BovinePrimaryMyoblasts

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从牛背最长肌中分离并培养的成肌细胞，保留成肌细胞的生物学特性，可分化为肌管细胞，是外泌体研究的首选细胞来源。

3.3无外泌体胎牛血清条件培养基ConditionedMediumwithExosome-DepletedFBS

使用预先去除了外泌体的胎牛血清所配制的细胞培养基（15%的无外泌体FBS+1%的100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素+84%的DMEM培养基）。

4.细胞培养与上清收集

4.1原代成肌细胞分离

4.1.1组织取材

根据DB51/T3128的规定选择健康的牛只，按GB/T35892和DB51/T2075的规定采集牛背最长肌组织（1月龄以内犊牛，体重50~80kg），无菌条件下去除脂肪和结缔组织，剪成1mm3小块，用含青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）的PBS缓冲液洗涤3次。

4.1.2酶解消化

按GB19489的规定将组织块转移至含0.2%胶原酶Ⅱ和0.25%胰蛋白酶的消化液中，37℃恒温摇床，180rpm振荡消化1h左右。消化完成后，加入适量含15%FBS的DMEM完全培养基终止消化。

4.1.3细胞过滤

消化液依次通过铺纱布的不同孔目的细胞筛过滤，收集滤液，1500×g离心5min，弃上清，沉淀用含15%FBS的DMEM培养基洗涤2次后，接着将沉淀用15%FBS的DMEM培养基重悬。

4.1.4原代培养

将重悬的细胞接种于明胶包被的培养瓶中，37℃、5%CO?培养箱培养，24h后更换培养基去除未贴壁细胞，此后每48h换液1次，至细胞融合度达80%~90%。弃去旧培养基，用PBS清洗细胞一次。加入适量0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化1～3min左右，加入含

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血清的完全培养基终止消化，随后将