牛体细胞体外培养与冷冻保存操作规程.docxVIP

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NXSLX

宁夏饲料工业协会团体标准

T/NXSLX0207—2025

牛体细胞体外培养与冷冻保存操作规程

Operatingrulesforinvitrocultureandcryopreservationofbovinesomaticcells

2025-11-7发布2025-12-7实施

宁夏饲料工业协会发布

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由宁夏大学提出。

本文件由宁夏饲料工业协会归口。

本文件起草单位：宁夏大学、宁夏农林科学院动物科学研究所、吉林农业大学、西北农林科技大学、海原县科学技术局、固原富民农业科技发展有限公司

本文件主要起草人：魏大为、姜超、张久盘、宋雅萍、马云、张娟、房义、黄永震、田平、张令锴、胡亚美、聂路玮、焦若普、杨东梅、龚红芳、马艺伦、何学亮、咸海龙

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牛体细胞体外培养与冷冻保存操作规程

1.范围

本文件规定了牛体细胞（主要为耳缘组织成纤维细胞）体外培养与冷冻保存操作的术语和定义、技术要求、质量检测、记录档案管理和注意事项。

本文件适用于牛体细胞分离培养与冷冻保存操作。

2.规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其最新版本适用于本文件（注：本文件中所涉及到的所有技术规程均遵循中华人民共和国生物安全法，且相关动物实验按照GB/T35892标准执行）。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T35892实验动物福利伦理审查指南

GB/T42466生物样本库多能干细胞管理技术规范

GB/T24863畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程

NY/T1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范

3.术语和定义

GB/T24863和NY/T1900界定的术语和定义适用于本文件。

4.技术要求

4.1组织样本采集

4.1.1牛只准备

确认牛只身份，记录品种、年龄、性别等信息。

4.1.2组织采集

按照GB/T24863的规定对牛耳缘组织进行消毒处理，然后用无菌活检打孔器（直径6-8mm）或无菌手术剪采集组织块，用无菌纱布按压伤口止血。

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4.1.3样本处理

样本组织块用75%酒精涮洗30s后，用无菌且含5%双抗（青霉素、链霉素）的PBS溶液清洗3遍，再将组织放入预冷的、含2%双抗的PBS溶液的无菌离心管中保存。

4.1.4样本运输

在4℃条件下尽快运送至实验室，最长不应超过24h。

4.2原代细胞培养

4.2.1准备操作

所有操作均在无菌环境中进行，使用无菌器械和耗材。

在培养皿中用含3%双抗的PBS溶液反复冲洗组织块，直至清洗液清澈。

4.2.2组织块法分离

将组织块剪成约1mm3的小块，均匀贴附于细胞培养瓶底，翻转培养瓶使组织块在上，于37℃、5%CO?培养箱中培养4～6h，待组织块稍干涸贴壁后，轻轻翻转培养瓶，加入完全培养基（10%FBS+1%双抗+89%DMEM/Highglucose），使其完全覆盖组织块。此时记为分离第0天，继续培养1周左右，少量成纤维细胞从组织块边缘迁出，在分离第10天左右，组织块四周均出现细胞时，去除组织块，更换新鲜培养基继续培养，之后每2天更换一次培养基。

4.2.3酶消化法分离

使用胶原酶I（0.1%～0.2%浓度）在37℃消化组织块1～2h，加入含20%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基终止消化，离心收集细胞沉淀，用完全培养基重悬，并接种于培养瓶中，培养16h后，更换培养基，观察细胞形态。

4.3传代培养

当细胞融合度达到80%～90%时进行传代。弃去旧培养基，用PBS清洗细胞一次。加入适量0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化1～3min。在显微镜下观察到细胞变圆、间隙增大时，立即加入含血清的完全培养基终止消化，吹打培养瓶底壁，制成单细胞悬液。将细

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胞悬液移入离心管，1000rpm离心5min。弃去上清，用新鲜完全培养基重悬细胞。按1：

2至1：3的比例将细胞悬液接种到新的培养瓶中，补充足量培养基，放入CO?培养箱，每2天更换一次培养基。

4.4细胞冷冻保存

4.4.1细胞冻存操作

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