宁夏地方黄牛体外胚胎冷冻保存技术规范.docxVIP

ICS65.020.30CCSB43

NXSLX

宁夏饲料工业协会团体标准

T/NXSLX0212—2025

宁夏地方黄牛体外胚胎冷冻保存技术规范

TechnicalSpecificationsfortheFreezingofInVitroEmbryosfromNingxiaLocalYellowCattle

2025-11-7发布2025-12-7实施

宁夏饲料工业协会发布

I

T/NXSLX0212—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由宁夏大学提出。

本文件由宁夏饲料工业协会归口。

本文件起草单位：宁夏大学、银川市畜牧技术推广服务中心、固原富民农业科技发展有限公司。

本文件主要起草人：胡亚美、魏大为、张令锴、蔡蓓、高亚伟、马云、淡新刚、陶金忠、孙嘉欣、何学良、咸海龙、李文迪、田雨、陈慧慧、侯佳洋、魏康康、马贵。

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宁夏地方黄牛体外胚胎冷冻保存技术规范

1.范围

本标准规定了宁夏地方黄牛体外胚胎冷冻保存的基本要求、胚胎准备与质量鉴定、冷冻方法、胚胎的储存、胚胎的解冻和档案记录的技术要求。

本标准适用于宁夏地方黄牛体外胚胎冷冻保存。

2.规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其最新版本适用于本文件（注：本文件中所涉及到的所有技术规程均遵循中华人民共和国生物安全法，且相关动物实验按照GB/T35892标准执行）。

GB/T5458液氮生物容器

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T25881牛胚胎

GB/T45202牛体外胚胎生产和移植技术规程

3.术语和定义

GB/T25881和GB/T45202界定的以及下列术语和定义适用于本文件本文件。

3.1宁夏地方黄牛NingxiaLocalYellowCattle

在宁夏回族自治区特定的大陆性气候和粗放式饲养管理条件下，经过长期自然和人工选择形成的地方黄牛种质资源。该品种具有良好的环境适应性、抗病力和耐粗饲性能。其体型结构紧凑，被毛多以黄色为主，属于肉役兼用或地方特色肉用牛种。

4.基本要求

4.1设施设备

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体视显微镜、胚胎冷冻仪、液氮罐、0.25mL胚胎细管、细管塞、装管器、酒精喷灯、恒温水浴锅、胚胎操作管/玻璃针、培养皿(35mm,90mm)、恒温加热台、0.22μm针头式滤器、记号笔、防护装备（低温手套、护目镜）等。

4.2试剂

4.2.1化学试剂纯度应达到细胞培养级或胚胎专用级。

4.2.2实验用水应符合GB/T6682中二级水的要求，25℃下的电阻率达到18.2MΩ·cm。

4.2.3胚胎冷冻液、解冻液及洗涤液的配制方法祥见附录A。

5.胚胎准备与质量鉴定

5.1胚胎质量鉴定

按照GB/T25881的规定执行。用于冷冻的胚胎，其发育阶段应为桑椹胚、囊胚或扩张囊胚，质量等级应为A级或B级。

5.2胚胎预处理

冷冻前，胚胎应在适宜的培养液中于38.5℃、5%CO?的培养条件下稳定至少1h。

6.冷冻方法

6.1程序化慢速冷冻法

6.1.1胚胎洗涤

a)基础洗涤：将胚胎在保存液（见附录A1），液滴中连续洗涤5-8次。每个液滴体积不小于200μL，每批次洗涤胚胎数不超过10枚。

b)脱颗粒细胞处理：将胚胎移入0.25%胰蛋白酶见附录A2，在38.5℃条件下洗涤2次，每次在液滴中停留30s-40s。处理后，立即按6.1.1a)的方法再洗涤3-5次，以彻底去除胰蛋白酶。

6.1.2冷冻保护剂平衡

胚胎在以下溶液中应按顺序平衡：

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a)在含0.75mol/L乙二醇的平衡液中平衡5min-10min。

b)在含1mol/L乙二醇的冷冻液中平衡5min-10min。

c)在含1.5mol/L乙二醇的冷冻液中平衡5min-10min。

6.1.3装管与标识

a)装管：将平衡后的胚胎装入0.25mL细管，每只细管装1枚胚胎。装管顺序为：棉塞（约2cm）-冷冻液（约2cm）-气泡（约0.5cm）-冷冻液（约2cm）-气泡（约0.5cm）-含胚胎的冷冻液（约