FAD葡萄糖脱氢酶生产工艺研究.pdfVIP

摘要

当前全球糖尿病患者已超过4．25亿，血糖检测的全球市场容量高达200多

亿美元。在酶电极法检测血糖的原料酶中，FAD葡萄糖脱氢酶(FAD．GDH)，能

够避免麦芽糖和氧分压对葡萄糖测定的干扰，在当下及未来血糖检测领域有着较

大的价值，研究制备FAD．GDH的生产工艺具有重要意义。

天然来源的茵发酵FAD．GDH，存在表达水平低、发酵液成分复杂难于纯化

等问题。已报道的FAD．GDH重组表达，停留在摇瓶和小规模发酵水平，缺少对

大规模发酵、发酵液预处理、柱层析等过程的详细阐述。

建立重组FAD-GDH生产工艺，需要解决F仰一GDH基因及表达菌的选择、

重组表达菌的构建、培养条件的选择、发酵的放大验证、发酵液的预处理和蛋白

纯化条件验证等问题。

本文通过分析和比较不同来源的FAD．GDH酶的性质及当前生产水平，从酶

的特异性、比酶活、当前产量、专利限制等因素考虑，发现土曲霉来源的

FAD．GDH具有工业化应用的潜力。从外源蛋白表达水平、表达后的修饰、培养

的复杂性等方面考虑，进行了毕赤酵母X．33及pPIczo载体构建FAD．GDH表达

菌的验证。通过单因素实验比较分析了四种碳源，发现甘油更适于FAD．GDH重

6．0的条件较

组毕赤酵母的培养和表达。设置不同pH条件下的诱导，发现pH

5．5条件更为合适。在摇瓶和发酵罐两个规模水平上，通

pH4．0、pH5．O、pH

过不同诱导温度的实验，发现30℃的诱导温度在表达量和产FAD—GDH的比酶

活上优于25℃和33℃条件下的诱导。进行不同批次的单因素发酵实验，发现

诱导过程中9m耿L铀)的甲醇流速较6ml“L％)和12m1／皿奉h)合适，发现溶氧水

平影响发酵过程产酸和发酵色素产生。验证了发酵规模从10L至100L的放大，

产酶量达到7736I(U。在发酵液预处理方面，发现混纤滤膜的过滤效果好于聚醚

砜滤膜，采用不同孔径滤膜级联过滤的方法，过滤时长缩短50％。发现上样量对

柱填料体积超过7m咖l时，会发生上样流穿损失增大的现象。柱层析过程中，

在lcl“min的线性流速下，蛋白回收率及纯化效率较高，Buf．ferA中添加30mM

的咪唑，会降低蛋白回收率，但能提升酶纯化后的比酶活。

本文研究方法所获得的FAD．GDH应用于血糖试纸时，电流信号与血糖浓度

线性相关系数达到O．9997，批间试纸条CV值小于15％。在一20℃条件下，保存4

Ⅱ

个月，酶的应用性能仍符合血糖试纸用酶的要求。本研究验证了FAD．GDH从

基因选取、菌种构建、发酵表达到分离纯化各生产工序的参数，积累了重要数据，

为Ⅳ①一GDH工业化生产积累了重要经验。

关键词：FAD葡萄糖脱氢酶：毕赤酵母重组表达；发酵工艺；发酵液预处理；

蛋白纯化

III

Abstract

than425millionwithdiabetes

Therearemorepeopleworldwide，and

cmenUy

reachedmoreth柚20billionU．S．

t11emarketforhas

910balblood酉ucosetesting

ofthe

mwusedinmedetection

tlleblood母ucoseby

dolIars．AmongeI目，Ines

the

elec仃odc