BIORAD荧光定量PCR原理和方法介绍课件.ppt

刚做实验的同学，很多时候希望别人帮自己设计好引物，其实这种方式是不可取的，首先是高估了引物设计的难度，其次也自己的实验别人了解的并不多，还有就是引物设计其实是实验者必备的技能。这里讲述下RT-PCR设计的基本原则。

1.上下游引物要保守：

为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行pcr扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。

在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5个bp保守。

5’NNNNNNN3’

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’NNNNNNNNN5’

2.上下游引物的长度和Tm值：

上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。

上游引物应标记F(forword)，且在基因组的位置及长度;下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。用oligo或primerpreiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃，长度相差最好不超过4bp。

3.引物的评价：

用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“createprimercatalog”，在“name”中输入引物的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primerselfdimer”,分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dimer，并对此引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primerhairpins”,分析引物的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的hairpins进行评价。再选择所需要的上下游引物，在“report”菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论??是dG值越大越好(dG值通常为负值)，绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行)。不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。;4.上下游引物与探针的距离(上下游引物的位置)：

理论上讲，上游引物的3’端离探针的5’端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的3’端离探针的3’端为4bp;下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3’端离探针的3’端最为15-150bp。整个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过200bp。

5.随机引物：

适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

6.OligodT：

适用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

7.基因特异性引物：

与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。缺点是只能用于单一基因的PCR实验。P