苏大分子生物学第九章.pptVIP

第九章??????目的基因的分离和克隆;第一节???????目的基因的获得;一、化学合成法自动化DNA合成仪;应用范围：1）合成PCR引物

2）寡核苷酸探针

3）人工接头及较小的基因

;二、建立基因组DNA文库;基因组文库大小的计算

1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：

In（1－P）

N=———————

In（1－f）

P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。

例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？

In（1－0.99）

N=———————————————=9.2×106

In（1－1.5×100／3×106）;若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。;;四、构建cDNA文库;特点：

cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操作更为方便。

mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特定功能基因工作量较小。

mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板。（转录特征）

可在原核细胞中表达有生物活性蛋白

不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同

不能研究基因组的结构功能

;构建cDNA文库

1.制备mRNA

1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料

2)从总的RNA中分离mRNA

将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[oligo(dT)]纤维素中进行亲和层析;2.第一股cDNA合成

1）以Oligo(dT)为引物：从模板3’末端开始，沿模板的3’→5’方向合成,对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA

2）随机引物：???6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）

3.第二股cDNA的合成

⑴自身引导法：

⑵置换合成法

⑶外加引物合成法

4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞

;筛选目的基因

⑴核酸杂交法特殊标记的寡核苷酸链为探针

将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）;⑵免疫结合法

噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125I标记的第二抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,提取DNA后经酶切可获目的基因。;获得目的基因的其他方法;第二节???????获得目的基因方法的选择;第三节??目的基因重组体的构建

;二、目的基因与载体的连接;㈡平端连接法

1.同聚物加尾法

2.用衔接物连接法

3.适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）

EcoRI粘性末端：5’－AGCGGCCGCG－3’

TCGCCGGCGCTTAA－5’

BamHI／PasI粘性末端：5’－GATCCGG…….CACTGCA－3’

3’－GCC…….GTG－5’