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纯化水洋葱菌（洋葱伯克霍尔德菌群）检查操作规程

第一章总则

第一条制定目的

为规范纯化水洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderiacepaciacomplex,Bcc，以下简称“洋葱菌”）的检查操作行为，确保检测结果准确、可靠，保障纯化水质量安全，防范因水质污染导致的交叉感染等风险，特制定本规程。

第二条制定依据

依据《2025年版中华人民共和国药典》通则1109“洋葱伯克霍尔德菌群检查法”、通则1105“非无菌产品微生物限度检查需氧菌总数检查”、《制药用水系统设计与实践》及《医疗机构消毒技术规范》等相关法律法规、标准规范制定。

第三条适用范围

本规程适用于各级医疗机构、制药企业等使用纯化水的单位，对纯化水进行洋葱菌专项检查的操作，包括样品采集、前处理、检测、结果判定及记录等全流程工作。本检查主要适用于风险评估表明存在洋葱菌污染风险的纯化水，如用于高风险制剂（吸入剂、口服溶液剂）生产的纯化水，或纯化水系统出现微生物污染趋势异常（如革兰阴性菌增多）时的专项检测。

第四条核心原则

1.无菌操作原则：全程严格执行无菌技术操作规范，避免样品采集、处理及检测过程中受到外源性污染，确保检测结果真实有效。

2.规范性原则：严格按照本规程及药典规定的检测方法、操作步骤开展检查，不得随意更改检测参数（如培养温度、培养时间、培养基类型等）。

3.质量可控原则：对检测过程中使用的培养基、试剂、仪器设备等进行严格质量管控，定期校准、验证，确保检测条件符合要求。

4.可追溯性原则：详细记录样品信息、检测过程、检测结果等关键数据，确保整个检测流程可追溯，便于质量核查与问题追溯。

第五条术语定义

1.洋葱伯克霍尔德菌群：一组革兰氏阴性、需氧、不发酵乳糖的细菌，广泛存在于自然环境中，可在水性环境中存活繁殖，对免疫功能低下人群具有致病性，是制药用水及医疗器械污染控制的重要指标菌。

2.纯化水：符合《2025年版中国药典》标准的水，用于制药工艺、医疗器械清洗、口腔诊疗等领域，其微生物限度要求需氧菌总数≤100CFU/mL，无大肠埃希菌等控制菌。

3.薄膜过滤法：将样品通过无菌滤膜过滤，使微生物截留在滤膜上，再将滤膜转移至特定培养基上培养，以实现微生物分离与计数的检测方法。

第二章人员、设备与材料准备

第六条人员准备

1.检测人员需经专业培训合格后上岗，熟悉本规程及洋葱菌检测相关知识，掌握无菌操作技能、仪器设备使用方法及结果判定标准。

2.上岗前需按要求穿戴个人防护装备：洁净工作服、工作帽、医用外科口罩、无菌手套；进入无菌操作间（或生物安全柜）操作时，需更换无菌防护服，严格执行手卫生规范（按“七步洗手法”洗手后进行手消毒）。

3.检测人员若患有传染性疾病（如流感、结核、肠道传染病等）或皮肤有破损、感染，需暂停参与检测工作，待病情治愈后再上岗。

第七条设备准备

1.核心检测设备：生物安全柜（二级及以上）、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱（可精确控制温度30-35℃）、薄膜过滤装置（含无菌滤杯、滤膜支架、真空泵）、电子天平（精度0.1g）、移液器（1mL、10mL、100mL）、冰箱（2-8℃，用于储存培养基、试剂）。

2.辅助设备：无菌采样瓶（500mL、1000mL）、无菌移液管、无菌培养皿、无菌镊子、无菌剪刀、酒精灯、酒精喷壶、计时器等。

3.设备检查与校准：检测前需检查所有设备运行状态，确保功能正常；恒温培养箱需提前预热至设定温度（30-35℃）并稳定；高压蒸汽灭菌器需定期进行灭菌效果验证；移液器、电子天平需按规定周期校准，确保精度符合要求。

第八条材料准备

1.培养基：R2A琼脂培养基（用于洋葱菌的分离培养，需符合药典标准）、选择性培养基（如Burkholderiacepacia选择性琼脂培养基，用于疑似菌落的筛选）、营养肉汤培养基（用于菌液增菌，必要时使用）。培养基需在有效期内使用，使用前需确认其外观（无浑浊、无沉淀、无变色、无破损），按说明书要求加热溶解后冷却至45-50℃备用。

2.试剂：无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）、中和剂（若样品存在抑菌成分时使用）、革兰氏染色液（用于菌落形态鉴别）、生化鉴定试剂（用于洋葱菌的确认鉴定）。所有试剂需标注名称、批号、有效期，储存条件符合要求。

3.无菌耗材：无菌滤膜（孔径0.45μm，直径47mm或50mm，纤维素酯或聚醚砜材质）、无菌采样袋、无菌棉签、无菌纱布等，确保包装完好、在有效期内，使用前需经灭菌处理（若为非无菌包装）。

第三章样品采集与前处理

第九条样品采集

1.采样时机：常规监测按企业/机构制定的纯化水质量监测计划执行；专项检测（如系统微生物异常时）需在发现异常后24小时内完成采样。

2.采样