分子生物学实验.pptVIP

分子生物学实验;目录;;一、实验目的;三、实验材料与试剂物品;2、试剂;3、仪器设备;五、结果与处理;;目的与要求

通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。;;;常用的质粒载体;细菌质粒:

细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。;严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；

松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。;载体(Vector)：

用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。;Insert;Ampr抗性基因;二、实验原理;DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。;细菌裂解的方法：

碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS

煮沸裂解法:沸水煮沸40秒

SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。;提纯的思路;紫外光吸收法：

因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。;3.材料与试剂

材料:含有质粒大肠杆菌JM83+。;三、实验仪器、材料与试剂;;;四、实验步骤;?

加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性

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12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管

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上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）

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12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管

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（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）

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12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管

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上清加2倍体积的无水乙醇??充分混匀），冰浴30min

?;12000rpm，离心15min

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沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）

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12000rpm，离心10min

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沉淀超净台中风干

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沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存;注意：

用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！;培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;

取液体培养液1.5-2ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液1(GET)，充分混匀放置3-5分钟;

加入200?l新配制的0.2mol/LNaOH+1％SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;;加入150?l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;

用冷冻高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;

沉淀用0.5ml70％乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;

加入30-50?l含有20?g/mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);

将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。;B.用分光光度计法定量DNA

取2?l提取的质粒DNA，加入98?l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);

蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。

;加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50?g/ml双链DNA，33?g/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。;记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:

ds