医学分子生物学技术.pptVIP

医学分子生物学实验技术;第一章蛋白质的分离与纯化;第一章蛋白质的分离与纯化;第一章蛋白质的分离与纯化;Date;Date;简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：

n=L/H

n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。;Date;Date;Date;洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。;顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。;Date;迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先一纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图。;层析流出曲线及相关术语;基线

在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。;

色谱流出曲线

色谱流出曲线和色谱峰

基线（a）

峰高（h）;保留值

死时间t0

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。

;;3.调整保留时间tr′

某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tr′=tr?t0

由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。

保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间??受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。;4.死体积V0

指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。

V0=t0Fco

式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。

仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。;5.保留体积Vr

指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：

Vr=trFco

6.调整保留体积Vr?

某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。

Vr?=Vr?V0=tr?Fco;7.相对保留值r2,1

某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。

r2,1=tr2?/tr1′=Vr2?/Vr1?

由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。;在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号?表示，即

?=tr?(i)/tr?(s)

式中tr?(i)为后出峰的调整保留时间，所以?总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。

区域宽度

色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。;

1.标准偏差?

即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。

2.半峰宽W1/2

即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为

W1/2=2.354?