亲和纯化技术课件.pptVIP

吸附：pH在6~8。洗脫：降低pH值、增加離子強度、或在緩衝液中加5mmol/LEDTA等方法。特點：蛋白質吸附容量大；價格便宜；具有普遍適用性。*（二）、聚丙烯醯胺凝膠及

其他凝膠衍生物活化與偶聯疊氮化法重氮化法(含氨基載體)碳二亞胺縮合法（含羧基載體）*聚丙烯醯胺凝膠載體的活化法有大量可修飾的醯胺基。醯胺基能被含氮化合物置換製備多種衍生物。*疊氮化法聚丙烯醯胺的醯肼衍生物，加1mol/L的亞硝酸，反應液攪90s；加入脂肪胺類配基，制得親和吸附劑。*重氮化法ω-氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲醯氯反應，制得對硝基苯甲醯胺烷基瓊脂糖衍生物。用連二亞硫酸鈉還原，亞硝酸鈉處理，得重氮鹽衍生物。配基與重氮鹽衍生物偶聯，制得親和層析柱。*碳二亞胺縮合法碳二亞胺為羧基活化劑。反應中的脲衍生物可用有機溶劑洗滌除去。*（三）、用於固定化配基的凝膠衍生物1、CNBr活化的Sepharose4BSepharose4B經CNBr活化，可偶聯蛋白和核酸類配基。2、AH-Sepharose4B和CH-Sepharose4B含有6個碳原子的”手臂”的瓊脂糖衍生物AH-Sepharose4B用於含有羧基的一類配基。CH-Sepharose4B能與含有一級氨基的配基偶聯。**3、環氧活化型Sepharose6B由親水“手臂”與Sepharose6B載體通過醚鏈形成的衍生物。用於小分子配基的固定化。用於偶聯脂多糖、蛋白等大分子配基。*4、活化型親和膠10和15由N-羥琥珀醯亞胺與瓊脂糖衍生物形成的活化酯。Affi-Gel10的“手臂”長為10個碳原子，產生一些負電荷，有利於鹼性或中性蛋白偶聯；Affi-Gel15為15個碳原子的“手臂”，產生一些正電荷，故有利於酸性蛋白的偶聯。*5、CM-生物膠A、親和膠202和親和膠102CMBio-GelA，無“手臂”的羧基衍生物；Affi-Gel102具有6個原子“手臂”，未端為氨基。Affi-Gel202具有10個原子的“手臂”，未端具有羧基；*五、影響吸附親和力的幾個因素KL配基濃度對親和力的影響空間障礙的影響配基與載體的結合位點的影響載體孔徑的影響微環境的影響*（一）、配基濃度對親和力的影響為將親和配體與其它物質分開，需要阻留值≥10。配基濃度與親和對解離常數相關。對於低親和力系統，配基濃度。*（二）、空間障礙的影響空間位阻。對於分子大的配體以及小分子配基更明顯。“手臂”，增加與載體相連配基的活動度，減輕載體的立體障礙。常用的“手臂”多為烴鏈。*（三）、配基與載體的結合位點的影響多肽或蛋白質等大分子配基須控制偶聯反應條件，使它以最少的功能基團與載體連接。保持蛋白質原有的高級結構，使親和吸附劑具有較大的親和力。*（四）、載體孔徑的影響載體孔隙是配體向配基接近的通道。孔徑大小對吸附劑親和能力有影響。（五）、微環境的影響載體及“手臂”的電性、極性對親和力的影響。避免引入離子鍵的基團。疏水作用的存在，會引起非特異性吸附作用。*六、配基與間隔臂的連接（一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接七、親和層析的吸附和洗脫影響吸附的條件親和層析的洗脫親和吸附劑的再生（一）、影響吸附的條件親和吸附劑及配體的性質緩衝液的種類、離子強度、pH、溫度和層析流速有關。溫度升高會使吸附作用減弱。流速每小時低於10ml/cm2。層析柱用前必須充分平衡。上樣體積為柱床體積的5%。非專一性吸附親和層析中的非專一性吸附。離子效應疏水基團複合親和力離子效應配基與載體-間隔臂的不完全結合，將無關離子基團引入吸附劑。具有離子基團的親和吸附劑會影響蛋白質的洗脫行為。疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質結構中的疏水區相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團：（1）長的烴鏈結構的“手臂”：（2）疏水性配基：複合親和力離子效應作用，又有疏水作用。配體與配基有較強生物特異性。用高濃度的鹽和有機溶劑，以提高選擇性。（二）、親和層析的洗脫洗脫：洗脫方法主要有三種：非專一性洗脫特殊洗脫專一性洗脫非專一性洗脫改變洗脫劑的pH。離子強度的分步和梯度變化.