琼脂糖凝胶电泳课件.pptVIP

*分離小於0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大於10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間於兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩衝液中(如誤加10×電泳緩衝液),則電導很高並明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

電泳緩衝液還有一個組分是EDTA，加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+等離子，防止電泳時啟動DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉澱。*瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectrophoresis一.電泳的概念帶電質點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現象稱為電泳。區帶電泳是在半固相或膠狀介質上加一個點或一薄層樣品溶液，然後加電場，分子在支持介質上或支持介質中遷移。支持介質的作用主要是為了防止機械干擾和由於溫度變化以及大分子溶液的高密度而產生的對流。根據支持介質的材料:瓊脂糖電泳凝膠電泳聚丙烯醯胺電泳二.實驗目的1、掌握agarosegelelectrophoresis的原理

及操作方法.（一）瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖是由瓊脂分離製備的鏈狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。該凝膠適合於免疫複合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本原理：在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數成反比；由於糖-磷脂骨架在結構上的重複性，相同數量的雙鏈DNA幾乎帶有等量的靜電荷，因此能以同樣的速度遷移。分子構型也對遷移率有影響，如共價閉環DNA＞直線DNA＞開環雙鏈DNA。（二）瓊脂糖凝膠電泳的應用質粒DNA限制性酶切圖譜的分析；DNA限制性酶切圖譜的分析；PCR產物的分析；純化特定的DNA片段；（三）影響電泳泳動率的四大因素1.樣品的物理性狀：分子大小、電荷多少、顆粒形狀和空間構象雙鏈DNA分子遷移的速率與其分子量常用對數近似成反比PlasmidDNAI型（閉環CC），超螺旋II型（單鏈開環OC），鬆弛III型（線性L）。I型?III型?II型2.支持物介質（agarose,PAGE)：濃度越低，相同核酸分子遷移越快；分離小於0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大於10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間於兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。3.電場強度：低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。4.緩衝液離子強度：TAE,TBE,TPE在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩衝液中(如誤加10×電泳緩衝液),則電導很高並明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。TAE、TPE及TBE電泳緩衝液比較都是常用電泳緩衝液。三者相比：1）TAE的緩衝容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側將發生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩衝容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對於高分子品質的DNA，TAE的解析度略高於TBE或TPE，對於低分子品質的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳解析度要好於TBE。核酸電泳的指示劑溴酚藍（bromophenolblue)二甲苯青藍FF（xylenecyanol)6×凝膠載樣緩衝液類型6×緩衝液貯存溫度I0.25%溴酚藍4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍室溫0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍4℃40%(m/V)蔗糖水溶液上樣緩衝液(Loadingbuffer）：作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內:10%-15%蔗糖或5%~10%甘油。2）使樣品帶有顏色便於簡化上樣過程。3）其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移:0.25%溴酚藍或其他指示染料。（四）瓊脂糖凝膠電泳裝置瓊脂糖凝膠電泳的觀察在瓊脂糖凝膠中加入溴化乙錠（eth