亲和分离技术课件.pptVIP

***問題：1、珍珠港事件----蛋白流失，感染2、急性腎炎----蛋白流失*乙醇的滲透蒸發分離，選用帶-COOH的膜，有利於分離除水（H2O與-COOH形成氫鍵）親和分離技術1 生物親和作用 由於不是整個分子或物質參與親和結合，親和作用的分子(物質)對可以是：大分子-小分子例，大分子-大分子例，大分子-細胞例，細胞-細胞例。親和作用的作用力 具有“鑰匙和鎖孔”的關係是產生親和結合作用的必要條件，但並不充分。除此之外，還需要分子或原子水準的各種相互作用2 親和作用的影響因素1)．離子強度 如Affinity主要源於靜電引力或氫鍵，則提高I無疑會減弱或完全破壞Affinity。 疏水性作用隨I提高而增大,因此，當Affinity作用主要源於疏水性相互作用時，增大I則可提高Affinity。 許多親和吸附的目標蛋白質可用高濃度鹽溶液洗脫，說明靜電引力在Affinity中佔有重要地位。2)．pH 在親和分離操作中,溶液pH值的選擇是非常重要的.3).抑制氫鍵形成的物質 脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵配基配體 的形成.因此,如果Affinity中存在氫鍵,則加入脲或鹽酸胍可減弱Affinity。但他們為強烈變性劑。4)．溫度T T?使分子和原子的熱運動?，結合中心的靜電作用、氫鍵及金屬配位鍵?，但可使疏水性作用?。5)．離液離子 SCN-，I-和ClO-4等半徑較大的陰離子能降低疏水相互作用。故，則這此離子會降低Affinity。6).表面活性劑/乙二醇7)．鼇合劑 如果Affinity源於親和分子對與金屬離子形成的配位鍵，則加入乙二胺四乙酸EDTA等鼇合劑除去金屬離子，可使Affinity消失。結合中心3 一般操作關鍵:?商品化的親和吸附介質亞胺二乙酸4 親和吸附介質Home-made親和吸附介質Home-made所需材料1st親和配基2nd載體Home-made基本方法 親和配基+載體=載體-親和配基天然吸附介質 如植物凝集素與糖具有親和結合作用，因此，天然瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠可直接用做外源凝集素的親和吸附介質。 例如:1st Sephadex凝膠是葡萄糖通過a-1.6結合與交聯製備的葡萄糖凝膠,可親和吸附伴刀豆球蛋白A(一種植物凝集素);2ndSepharose凝膠中含有半乳糖,在Ca2+離子存在下可親和吸附蛇毒凝集素.已介紹?5 親和配基A蛋白(proteinAorA抗原) 分子量約42kD，存在於金黃色葡萄球菌的細胞壁中，占細胞壁構成成分的約5%。 A蛋白與動物IgG具有很強的親和結合作用，每個A蛋白含有5個Fc片段結合部位。除IgG外，還與人IgG和人IgA也具有親和結合作用，但較弱。凝集素lectin 與糖特異性結合的蛋白質的總稱(酶和抗體除外)，大部分凝集素為多聚體。如。常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA,conA)與葡萄糖和甘露糖的親和結合作用較強,麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)與N-乙醯葡萄糖胺親和結合作用較強。抗體 抗體與抗原之間具有高度特異性結合能力，結合常數一般為107~1012dm3/mol。因此，利用以單抗為配基的免疫和色譜法是高度純化蛋白質類生物大分子物質的有效手段。酶抑制劑 可與酶的活性部位結合,但結合後抑制酶的活性。如1st 大分子抑制劑：如胰蛋白酶有胰髒蛋白酶抑制劑PTI、卵粘蛋白(ovomucoid)和大豆胰蛋白酶抑制劑,STI)等,2nd小分子抑制劑：如有苄脒、精氨酸和賴氨酸均可抑制胰蛋白酶的活性，並可作為親和純化胰蛋白酶的配基。5 親和配基輔酶和磷酸腺苷 脫氫酶和激酶需要在輔酶co-enzyme的存在下表現其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和結合作用。輔酶主要有輔酶I(NAD)、輔酶II(NADP)和ATP等。此外，AMP,ADP的腺苷部分與上述輔酶的結構類似，與脫氫和激酶同樣具有Affinity。三嗪類色素 三嗪類色素(triazinedyes)是一類分子內含有三嗪環的合成活性染料，與各種需要在NAD的存在下表現其生物活性的脫氫酶和激酶具有結合作用。這類結合具有抑制酶活性的作用。 三嗪類色素還與白蛋白、INF、核酸酶和糖解酶等具有很高的親和結合能力的. CibacronBlue3GA(又稱ReactiveBlue2)是最常用的活性色素過渡金屬離子 Cu2+、Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡金屬離子可與N，S和O等供電子原子產