亲和嫁接技术课件.pptVIP

***問題：1、珍珠港事件----蛋白流失，感染2、急性腎炎----蛋白流失*問題：1、珍珠港事件----蛋白流失，感染2、急性腎炎----蛋白流失*問題：1、珍珠港事件----蛋白流失，感染2、急性腎炎----蛋白流失*乙醇的滲透蒸發分離，選用帶-COOH的膜，有利於分離除水（H2O與-COOH形成氫鍵）親和嫁接技術1 親和膜過濾比較?解決之道?1 親和膜過濾設計比較:柱高/直徑=250/4.6 =54.3 柱高/直徑=200/252 =0.794Cu-IDA-Seph-aroseCL-6Bφ252×200IDA-Sepha-roseCL-6Bφ252×100design?1 親和膜過濾.如柱體積一定(即料液處理能力一定)降低柱高增大柱徑?p不變流速提高分離速度提高“短粗”型親和柱為使分離速度達到極限值，“理想”的層析柱幾何形狀應該是柱高等於介質直徑結果?1 親和膜過濾 親和膜(Affinitymembrane)利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。所以，利用親和膜的純化方法又稱membrane-basedaffinitychromatography結果=親和膜親和膜吸附分離的原理時間比較1st外擴散-吸附時間比較:利用BSA抗體修飾的Sepharose為介質吸附BSA，基於二級反應動力學常數計算的擴散-吸附反應時間為5s.2nd內擴散-吸附時間:利用tD=L2D/D計算,BSA在粒徑為100umSepharose中擴散-吸附所需平均時間為(50?10-4)2/(6?10-7)=41s，實驗材料比較優點1st傳質阻力小,達到吸附平衡的時間短;2nd壓降小，流速快;3rd設備體積小;4th配基利用率高,配基用量低.缺點:1st從分離效率的角度，因膜的厚度(柱高)很小(一般為10~100um)，理論板數很低;2nd膜的污染和膜孔的堵塞使操作速度、吸附效率和親和膜的壽命下降.1 親和膜過濾結果:利用含10cm3膜材料的小型親和膜設備可在15分鐘內完成1.2dm3粗料液的純化處理，單抗回收率為97%，其中除去了95%的核酸和99.5%的牛血清白蛋白3rdSepracor公司實驗結果表明，利用300美元A蛋白可純化8萬美元的單抗。由於該純化系統將除菌、純化和濃縮操作一步完成，分離速度可達到傳統層析法的100倍。應用1st螺旋卷式膜組件(美國CunoCo.)膜材料:纖維素一A蛋白/乙烯配基操作方式:流體沿徑透過膜組件，中心管流出，操作壓:低於0.07MPa,透過流量達100~1000cm3/min結果:利用固定化A蛋白吸附各種來源不同的IgG實驗表明，每克膜材料吸附7~19mgIgG，回收率為91~100%。2nd中空纖維型微濾膜組件(美國Sepracor公司):膜材料:纖維素一A蛋白實驗:純化含血清培養液中的小鼠單抗的實驗Why?2 親和過濾4th利用CibacronblueF3G-A修飾的微濾膜(膜厚210um，孔徑0.45um，修飾密度為7umol/cm3)吸附葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)動力學實驗結果:當料液中含有相當於膜吸附容量約67%G6PDH時，0.25s(壓力=0.4MPa，線速度=5cm/min)的平均停留時間就足以使吸附達到飽合。當G6PDH含量達到膜吸附容量的130%時，所需的平均停留時間不超過1s。純化結果:利用體積僅4.83cm3的親和膜在9分鐘內即完成了0.6dm3料液的純化處理，G6PDH收率達82%，比活提高27倍。非常有用的實驗技術2 親和錯流過濾超濾膜/微濾膜存在問題: 孔徑有很寬的分佈範圍，因此，單純的超濾/微濾分離蛋白質等生物大分子的選擇性很低，一般只有當兩種組分的分子量相差10倍以上時才有可能得到完全分離。辦法: 親和錯流過濾(affinitycross-flowfiltration,ACFF)or親和過濾(affinityfiltration),or親和超濾(affinityultrafiltration).是親和技術與膜分離相結合的分離純化技術，是親和層析的另一種變形.操作: 2 親和錯流過濾優點(