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D-乳酸产生菌株基因敲除：技术、应用与展望

一、引言

1.1D-乳酸概述

D-乳酸，又称(R)-2-羟基丙酸、D-2-羟基丙酸，是一种无色至微黄色澄清粘性液体，带有微酸味且具有引湿性，其水溶液显酸性反应。它的分子式为C_{3}H_{6}O_{3}，分子量为90.08，熔点为52.8°C，沸点达227.6°C，蒸气压在25°C时为3.8Pa。D-乳酸能与水、乙醇或乙醚任意混合，但在氯仿中不溶。作为乳酸的一种旋光异构体，D-乳酸在诸多领域有着不可或缺的作用。

在医药领域，高光学纯度（97%以上）的D-乳酸是合成多种手性药物的关键前体，其手性结构对于药物的活性和特异性至关重要。例如在一些钙拮抗剂降压药、皮考啉酸衍生物的合成中，D-乳酸作为重要原料，其精确的手性构型保证了药物分子与靶点的有效结合，从而发挥治疗作用。在农药领域，以D-乳酸为原料合成的高效低毒农药及除草剂，如日本タィセル化学工业公司利用D-乳酸制造的优良除草剂骠马(PumaSuper)，德国Hoeehst公司开发的以D-乳酸为原料的新型高效除草剂威霸(WhipSuper)，以及德国BASF公司以D-乳酸异丙酯为原料生产的除草剂Duplosan，这些农药不仅提高了除草效果，还减少了对环境的危害，符合现代农业可持续发展的需求。在化工领域，D-乳酸及其酯类广泛应用于香料、合成树脂涂料、胶粘剂及印刷油墨等生产中。D-乳酸甲酯作为一种优秀的高沸点溶剂，能与水及多种极性溶剂均匀混合，对硝化纤维素、醋酸纤维素、乙酰丁酸纤维素等以及多种极性合成高分子聚合物具有良好的溶解性，同时由于其熔点高、蒸发速度慢的优点，在石油管道和电子工业的清洗等方面也发挥着重要作用。此外，D-乳酸还是生物可降解材料聚乳酸(polylactide,PLA)的重要原料。由高光学纯D-乳酸聚合而成的聚乳酸材料，具有良好的生物相容性和可降解性，能够替代普通化工产品聚合而成的塑料、纤维制品，应用于医用骨内固定物、香烟过滤头、纺织用高级纤维等高端消费领域，也是3D打印技术的主要原材料之一。在食品领域，D-乳酸可用作酸味剂，为食品提供柔和的酸味，同时还具有一定的防腐保鲜作用，有助于延长食品的保质期。随着人们对健康和环保意识的不断提高，D-乳酸在可生物降解材料和绿色食品添加剂等方面的需求日益增长，其市场前景十分广阔。

1.2D-乳酸产生菌株

常见的D-乳酸产生菌株包括乳酸菌、大肠杆菌、克雷伯菌和芽孢杆菌等。这些微生物能够利用糖类等有机物作为基质，通过发酵代谢途径将其转化为D-乳酸。以乳酸菌为例，其代谢机制主要是通过糖酵解途径将糖类转化为丙酮酸，然后在D-乳酸脱氢酶的作用下，丙酮酸被还原为D-乳酸。不同的乳酸菌种类在发酵特性上存在差异，德氏乳杆菌保加利亚亚种作为一种常见的D-乳酸生产菌株，对培养基的要求较高，可利用乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖多种糖类为单一碳源。由于此菌不能合成大部分的氨基酸，所以需要从培养基中获得。其最佳发酵温度为37°C左右，在该温度下，菌株的酶活性较高，代谢途径顺畅，能够高效地将糖类转化为D-乳酸。当培养温度达到40°C左右时，D-乳酸的产率显著降低，这可能是由于高温影响了菌株内相关酶的活性，导致代谢途径受阻。大肠杆菌在特定的基因工程改造后也能够高效生产D-乳酸。通过对其代谢途径的优化，如增强关键酶的表达、阻断副反应途径等，可以提高D-乳酸的产量和纯度。在克雷伯菌和芽孢杆菌中，也存在着独特的代谢机制来合成D-乳酸。克雷伯菌能够利用不同的碳源进行发酵，其代谢过程受到多种因素的调控。芽孢杆菌则具有较强的环境适应能力，在一些特殊的环境条件下仍能保持较高的D-乳酸生产能力。这些D-乳酸产生菌株在工业生产中具有重要地位。随着对D-乳酸需求的不断增加，利用微生物发酵生产D-乳酸成为了一种重要的生产方式。微生物发酵法具有环境友好、成本相对较低、产物纯度高等优点。通过筛选和培育优良的D-乳酸产生菌株，优化发酵工艺条件，可以实现D-乳酸的大规模、高效生产。这不仅能够满足市场对D-乳酸的需求，还能推动相关产业的发展，如聚乳酸材料产业、生物制药产业等。

1.3基因敲除技术的重要性

基因敲除技术是一种现代生物技术手段，通过精准地去除生物体基因组中的特定基因，从而研究该基因的功能，或实现对生物体特定性状的改良。自上世纪80年代诞生以来，基因敲除技术不断发展完善，已广泛应用于多个生物学领域。在微生物研究中，基因敲除技术发挥