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基于单域重链抗体的天然噬菌体文库构建及抗DON适配体淘选技术研究

一、引言

1.1研究背景与意义

天然噬菌体文库作为一种能够产生多样性单克隆抗体的生物库，在生物医学和生物技术领域展现出广阔的应用前景。噬菌体展示技术巧妙地将外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，使得表达出的融合蛋白展示于噬菌体表面，进而构建出包含丰富蛋白质或多肽信息的文库。这种技术成功实现了基因型与表型的直接关联，为后续的筛选和研究工作提供了极大便利。

在众多类型的抗体中，单域重链抗体（heavy-chainonlyantibody，HcAb）因其独特的结构特点而备受关注。它无需轻链即可产生具有结合活性的抗体，仅包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区。单域重链抗体分子量小，仅有12-15kDa，这赋予了它出色的组织穿透能力，使其能够轻易进入致密的实体瘤组织发挥作用，甚至可以有效穿透血脑屏障。此外，其结构简单，易于进行基因改造，在原核或真核系统中都能实现高表达，且对人的免疫原性弱。这些优势使得单域重链抗体在疾病诊断与治疗、生物传感器开发以及蛋白质-蛋白质相互作用研究等诸多领域具有巨大的应用潜力。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，是一种由镰刀菌属真菌产生的常见霉菌毒素。它广泛污染小麦、玉米、大麦等谷物及其制品，对食品安全构成严重威胁。人类和动物摄入被DON污染的食物后，可能引发呕吐、腹泻、免疫抑制、生长发育受阻等一系列健康问题，严重时甚至会危及生命。因此，建立快速、准确、灵敏的DON检测方法对于保障食品安全和人类健康至关重要。

适配体是一类通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选得到的寡核苷酸或多肽分子，它们能够与靶标分子高特异性、高亲和力地结合。抗DON适配体作为检测DON的关键识别元件，具有成本低、稳定性好、易于修饰等优点，在DON的检测中展现出独特的优势。基于单域重链抗体构建天然噬菌体文库，并从中淘选出高亲和力的抗DON适配体，有望为DON的检测提供一种更为高效、灵敏的新方法。一方面，天然噬菌体文库的多样性能够为筛选提供丰富的分子资源，增加获得高亲和力适配体的概率；另一方面，单域重链抗体的优良特性可以进一步提升适配体的性能，如增强其稳定性和组织穿透能力，从而提高检测的准确性和可靠性。

1.2国内外研究现状

在天然噬菌体文库构建方面，国内外学者已取得了一系列重要进展。通过不断优化构建方法和技术，文库的容量和多样性得到了显著提升。例如，采用无缝克隆技术提高了外源基因与噬菌体载体的连接效率，减少了碱基错配和连接失败的情况，使得更多的抗体基因能够准确地整合到噬菌体中，为构建高质量的噬菌体展示文库奠定了坚实基础。利用合成生物学技术，科研人员能够精确合成具有特定序列和功能的抗体基因片段，通过巧妙组合这些片段，构建出具有高度多样性的噬菌体展示文库，不受天然基因资源的限制，大大拓展了文库的多样性。然而，目前文库构建过程中仍存在一些问题，如基因克隆效率有待进一步提高，文库的质量和稳定性在不同实验条件下存在一定差异，这些问题限制了天然噬菌体文库的广泛应用。

单域重链抗体的应用研究也取得了丰硕成果。在疾病诊断领域，基于单域重链抗体开发的诊断试剂能够实现对疾病标志物的快速、准确检测，提高了疾病早期诊断的准确性。在治疗领域，单域重链抗体作为治疗性药物的候选分子，展现出良好的应用前景，如针对肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗研究正在不断深入。在生物传感器开发中，单域重链抗体作为识别元件，显著提高了传感器的灵敏度和选择性。尽管如此，单域重链抗体在应用过程中也面临一些挑战，如如何进一步提高其亲和力和特异性，降低免疫原性，以及优化其在体内的药代动力学特性等。

抗DON适配体的筛选研究同样备受关注。国内外科研人员采用多种筛选技术和方法，成功筛选出了一系列具有较高亲和力和特异性的抗DON适配体。这些适配体被广泛应用于DON的检测，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、荧光偏振免疫分析、表面等离子共振等检测方法。目前抗DON适配体的筛选和应用仍存在一些不足之处，如筛选过程较为繁琐、耗时，适配体的亲和力和稳定性有待进一步提高，检测方法的灵敏度和特异性在实际样品检测中还需进一步验证等。

1.3研究目标与内容

本研究旨在构建基于单域重链抗体的天然噬菌体文库，并从中淘选出高亲和力的抗DON适配体，为DON的检测提供新的技术手段和生物材料。具体研究内容包括：

天然噬菌体文库的构建：收集多种不同类型的重链抗体基因，运用分子生物学技术构建基因文库。将基因文库转入噬菌体表达载体中，通过优化载体选择和构建条件，确保载体能够适应噬菌体感染和可溶性表达的要