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沙冬青ErbB3结合蛋白基因转化杏的研究

摘要

本研究旨在通过花粉管通道法，将沙冬青抗寒基因AmEBP1转化至‘大果’杏中，以提升杏树的抗寒特性并丰富抗寒杏的种质资源。通过幼胚培养、卡那霉素筛选、PCR及Southern检测，成功获得5个转基因阳性株系，并对转基因株系进行扩繁与生根成苗，同时对转基因组培苗的抗寒性能展开分析。研究结果表明，利用花粉管通道法可有效转化杏抗寒基因，为培育抗寒杏新品种奠定基础。

关键词

沙冬青；ErbB3结合蛋白基因；杏；花粉管通道法；抗寒性

一、引言

杏(PrunusarmeniacaL.)作为一种重要的经济果树，在全球广泛种植。然而，低温寒害常常对杏树的生长、发育以及产量造成严重影响。尤其是在北方地区，冬季的低温和春季的倒春寒，常常导致杏树遭受冻害，花芽受冻、枝条干枯，严重时甚至整株死亡，极大地限制了杏产业的发展。因此，提高杏树的抗寒能力，培育抗寒新品种，成为杏树育种工作的重要目标之一。

沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)是一种生长于内蒙古沙漠地区的常绿抗寒木本植物，长期在恶劣的低温环境中生存，使其进化出了一套独特的抗寒机制，蕴含丰富的抗寒基因资源。其中，ErbB3结合蛋白基因(AmEBP1)在沙冬青的抗寒过程中发挥着重要作用。研究表明，将该基因导入其他植物，有可能提高受体植物的抗寒能力。

花粉管通道法作为一种简便、高效的转基因方法，已在多种植物中得到应用。其原理是利用植物授粉后形成的花粉管通道，将外源基因导入受精卵或早期胚胎细胞中，从而实现基因转化。该方法操作简单，无需复杂的组织培养和原生质体转化技术，且转化材料为整株植物，更符合植物自然生长规律，有利于后续的遗传稳定性和性状表达。

本研究旨在利用花粉管通道法，将沙冬青抗寒基因AmEBP1转化到‘大果’杏中，获得具有抗寒特性的转基因杏植株，为培育抗寒杏新品种提供理论依据和技术支持，同时也为进一步丰富抗寒杏的种质资源奠定基础。

二、材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

供体材料为沙冬青，其抗寒基因AmEBP1由中国科学院遗传发育所王斌研究员实验室与山东泰山林科院共同构建并提供。该基因采用分子克隆方法(cDNA-AFLP和RACE)从沙冬青中克隆获得，基因库注册号为DQ519359，其ORF区域长1188个核苷酸，编码395个氨基酸和一个终止密码子(TGA)。

受体材料为‘大果’杏，选取生长健壮、无病虫害的成年‘大果’杏树作为实验材料，种植于山东泰山林科院实验果园内，用于花粉采集和杂交授粉。

2.1.2质粒与菌株

含有目的基因AmEBP1的重组质粒由实验室保存，该质粒载体为pBI121，含有卡那霉素抗性基因(nptⅡ)作为筛选标记。大肠杆菌菌株DH5α用于质粒的扩增与保存。

2.2方法

2.2.1质粒DNA提取

将含有重组质粒pBI121-AmEBP1的大肠杆菌DH5α接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。采用碱裂解法提取质粒DNA，具体步骤参照《分子克隆实验指南》。提取的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并通过核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，调整浓度至1μg/μL备用。

2.2.2花粉采集与处理

在‘大果’杏盛花期，选取晴朗无风的上午，采集即将开放的铃铛花。将采集的花朵带回实验室，在超净工作台上，用镊子轻轻取下花药，置于无菌滤纸上，在25℃左右的恒温培养箱中干燥24h，使花药开裂散出花粉。将收集的花粉置于1.5mL离心管中，加入适量的含有10%蔗糖、100mg/L硼酸和0.1%氯化钙的花粉萌发培养基，轻轻振荡使其均匀悬浮，备用。

2.2.3杂交授粉

选取‘大果’杏树上生长健壮、花朵发育良好的花枝作为授粉对象。在花朵开放当天，去除花瓣和雄蕊，保留雌蕊。用微量移液器吸取适量含有目的基因质粒DNA的花粉悬浮液，轻轻滴加在雌蕊柱头上，确保花粉均匀覆盖柱头。为防止非转基因花粉的污染，授粉后立即用硫酸纸袋进行套袋隔离，并做好标记。每个花枝授粉5-10朵花，共授粉500朵花左右。

2.2.4幼胚培养与卡那霉素筛选

授粉后30-35天，采集授粉果实。将果实表面用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗5-6次。在无菌条件下，切开果实，取出幼胚，接种于改良WPM培养基(添加100mg/L肌醇、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L盐酸硫胺素、20g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH5.8)上进行培养。培养条件为温度(25±2