病理学常用研究方法(研究生课程).pptVIP

病理学常用研究方法;;;一、免疫组化标准化问题探讨;(一)方法的选择;S-P法的优点

①方法统一

②有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒

③一般2-3小时(30’-60’)，而ABC法需1天，分

子量小(60KD)，穿透力强

④灵敏性高，特异性强，4个亚基都能于二抗上的生

物素结合，而且结合键强

⑤背景低，非特异性反应少，等电点为6.5，接近于

中性，不与内源性凝集素样物质结合,而ABC法为10;S-P法与ABC法的区别;;(二)固定、包埋;包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在65℃以下;(三)抗原修复(抗原暴露、抗原复原);抗原修复的目的：

就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：;热修复：

0.01M柠檬酸缓冲液，PH=6.0，95℃，10分钟

注意：脱片多——多聚L赖氨酸

干片

选医用微波炉

酶消化：1.细胞内抗原——0.1%胰蛋白酶20’37℃

2.间质抗原——4%胃蛋白酶37℃，4-8小时;(八)免疫组织化学的发展;2.原位免疫PCR

在组织切片上有定位

Ag+Ab1+Ab2→卵白素→洗净→生物素标记的DNA片断→洗净→原位PCR扩增→洗净→ACB或S-P显色

特点：①提高阳性率

②定位好;2.扩增：;3.Agarose2-5%，用1×TBE电泳

①扩增后液5μl+1μlloadingbuffer

②溴化乙淀染色20’，UV照射下确认泳带→照相;三、WesternBlotting;2.蛋白定量

标准蛋白浓度制备：BSA，0，0.5，1，2mg/ml

比色：测定系数

换算成含量→计算出每个样品加样量

3.电泳

丙烯酰胺上部胶、下部胶marker样品

4.转膜

5.洗膜→一抗、二抗→显色或自显影;四、组织芯片(TissueMicro-Array,TMA);应用

免疫组化

DNA或RNA原位杂交

FISH

原位PCR;制作过程;谢谢大家！