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WB实验步骤详细总结

WesternBlot（蛋白质印迹法）作为生命科学研究中最常用的蛋白质分析技术之一，凭借其高特异性和灵敏度，在蛋白质表达水平检测、蛋白质定性与半定量分析中占据着不可或缺的地位。其基本原理是通过凝胶电泳分离蛋白质混合物，随后将其转移到固相支持物上，再利用抗原抗体的特异性结合进行检测。一份高质量的WB结果，离不开严谨的实验设计、规范的操作流程以及对细节的极致追求。本文将从实验准备到结果分析，系统梳理WB实验的关键步骤与核心要点，旨在为科研工作者提供一份实用的操作指南。

一、实验准备与样品制备：源头把控是关键

WB实验的成功，始于高质量的样品制备。这一阶段的核心目标是获得具有代表性、完整性和稳定性的蛋白质样品，并准确测定其浓度，为后续实验奠定坚实基础。

1.1实验设计与试剂准备

在正式开始实验前，清晰的实验设计至关重要。需明确实验目的、预期结果，选择合适的内参蛋白（如β-actin,GAPDH,Tubulin等，需注意其在不同组织和处理条件下的表达稳定性），并规划好生物学重复与技术重复的设置，以确保结果的可靠性与可重复性。同时，需根据目标蛋白的特性（分子量、表达丰度等）选择合适的抗体，并确保抗体的特异性与效价。所有试剂，包括各种缓冲液、电泳相关试剂、转膜试剂、抗体及显色底物等，均需提前检查其有效性，关键试剂如蛋白酶抑制剂应确保新鲜。

1.2样品收集与裂解

样品的收集与裂解是蛋白质提取的第一步，操作需迅速且温和，以最大限度减少蛋白质降解和修饰。

*细胞样品：贴壁细胞需用预冷的PBS洗涤2-3次，去除残留培养基；悬浮细胞则通过离心收集后，用预冷PBS洗涤。随后加入适量预冷的含有蛋白酶抑制剂（有时根据需求加入磷酸酶抑制剂）的细胞裂解液（如RIPA裂解液、NP-40裂解液等，根据目标蛋白的溶解性和亚细胞定位选择），冰上裂解适当时间（通常15-30分钟），期间可轻柔吹打或涡旋。

*组织样品：新鲜组织需尽快用预冷PBS洗去血液和杂质，剪碎后加入液氮研磨成粉末，或直接在预冷的裂解液中使用组织匀浆器（如Potter-Elvehjem匀浆器或超声破碎仪）进行匀浆。组织裂解通常需要更长时间或更剧烈的物理破碎。

*裂解后处理：裂解完成后，于4℃下高速离心（通常12,____,000×g，10-15分钟），取上清液即为总蛋白提取物。离心的目的是去除细胞碎片、核碎片及未裂解的物质。

1.3蛋白浓度测定

为确保上样量的准确性和实验的可重复性，必须对提取的蛋白样品进行浓度测定。常用的方法有BCA法、Bradford法（考马斯亮蓝法）和Lowry法等。

*BCA法：灵敏度高，线性范围宽，受去污剂影响较小，是目前最常用的方法之一。操作时需制备标准蛋白浓度梯度，样品适当稀释后与BCA工作液混合，37℃孵育一段时间后测定特定波长的吸光度，根据标准曲线计算样品浓度。

*Bradford法：操作简便快速，但对去污剂较敏感。考马斯亮蓝G-250在酸性条件下与蛋白质结合后显色，测定特定波长吸光度。

*操作要点：标准曲线的线性关系需良好，样品应做适当稀释使其浓度落在标准曲线范围内，每个样品建议设置复孔。

二、SDS凝胶电泳：精准分离的核心

SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是基于蛋白质分子量大小分离蛋白质的经典方法。

2.1凝胶的配制

根据目标蛋白的分子量大小选择合适浓度的分离胶（下层胶）和浓缩胶（上层胶）。丙烯酰胺的浓度决定了凝胶的孔径大小，浓度越高，孔径越小，适用于分离小分子蛋白；反之则适用于分离大分子蛋白。

*分离胶：按比例混合超纯水、30%丙烯酰胺混合液、分离胶缓冲液（通常为Tris-HCl，pH8.8）、10%SDS、10%过硫酸铵（APS，新鲜配制或分装保存）和TEMED（四甲基乙二胺）。轻轻混匀后注入制胶板中，留出浓缩胶的空间，并在胶面上覆盖一层水或异丙醇以隔绝空气，促进聚合。

*浓缩胶：待分离胶完全聚合后（通常30-60分钟），倒掉覆盖液，用超纯水冲洗胶面，吸干水分。按比例混合超纯水、30%丙烯酰胺混合液、浓缩胶缓冲液（通常为Tris-HCl，pH6.8）、10%SDS、10%APS和TEMED。混匀后注入分离胶上方，立即插入梳子，避免产生气泡，待其完全聚合。

2.2样品处理与上样

*样品变性：根据测定的蛋白浓度，取等量蛋白（通常20-50μg，或根据抗体灵敏度调整），加入适量上样缓冲液（含SDS和β-巯基乙醇或DTT的LoadingBuffer），煮沸5-10分钟，使蛋白质充分变性并带上负电荷。

*上样：将聚合好的凝胶安装到电泳槽中，加入电泳缓冲液（Tris-甘氨酸-SDS缓冲液），确保没过凝胶。小心拔出梳子，用微量进样器吸取变性后的样