CN113234617A 利用餐厨垃圾制作农用酵素的专用发酵菌种的方法及专用发酵菌种 （上海大学）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN113234617A

(43)申请公布日2021.08.10

(21)申请号202110359585.6

(22)申请日2021.04.02

(71)申请人上海大学

地址200444上海市宝山区上大路99号

(72)发明人金智胡雪峰王新栋蓝文翀杜婧瑜李常贺

(74)专利代理机构上海上大专利事务所(普通合伙)31205

代理人顾勇华

(51)Int.CI.

C12N

C12N

C12QC12Q

C05F

1/20(2006.01)

1/16(2006.01)

1/6895(2018.01)

1/689(2018.01)

17/20(2020.01)

权利要求书3页说明书7页

(54)发明名称

利用餐厨垃圾制作农用酵素的专用发酵菌种的方法及专用发酵菌种

(57)摘要

CN113234617A本发明公开了一种利用餐厨垃圾制作农用酵素的专用发酵菌种的方法及专用发酵菌种，包括专用发酵菌种培养基配置、培养、筛选、分子生物学鉴定、专用发酵菌种扩繁。本发明通过对餐厨垃圾制作农用酵素优势菌种筛选与纯化，菌种生物分子鉴定和扩繁，获得高浓度餐厨垃圾制作农用酵素专用发酵菌种。在餐厨垃圾制作农用酵素发酵过程中，添加此发酵菌种，将极大缩短发酵时间，提升农用酵素的品质和产量，使餐厨垃圾制作的农用酵素更广泛地使用于农业生产中，促进绿色和有机农业发展。本发明旨在扩大对优势专用菌种的繁育，提高餐厨垃圾制作农用酵素的效率和品质，提升农用酵素社会效益和经济效

CN113234617A

CN113234617A权利要求书1/3页

2

1.一种利用餐厨垃圾制作农用酵素的专用发酵菌种方法，其特征在于：包括专用发酵菌种培养基制备、菌种培养、菌种筛选、菌种分子生物学鉴定、专用发酵菌种扩繁过程，采用以下步骤：

步骤1:专用发酵菌种的筛选与纯化：

a.培养基制备：

a-1.采用乳酸菌通用(MRS)培养基，包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、乙酸钠、磷酸氢二钾、吐温-80、葡萄糖、MnSO?·4H?O、MgSO?·7H?0、柠檬酸铵、蒸馏水、固体培养基加琼脂、无菌碳酸钙；

a-2.采用酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基，包括蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、固体培养基加琼脂、蒸馏水；

a-3.采用醋酸菌(AM)培养基，包括如下：

a-3-1.固体培养基：葡萄糖、酵母膏、无水乙醇、0.04%的溴甲酚紫、琼脂、水；

a-3-2.液体培养基：葡萄糖、酵母膏、丙三醇、水；

b.菌种培养：

b-1.取1mL餐厨垃圾自然发酵液，用无菌水逐级稀释，得到101~10?共7个梯度稀释液；吸取100μL各梯度的菌悬液，分别涂布于乳酸菌通用(MRS)培养基、酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基和醋酸菌(AM)培养基上；其中，乳酸菌通用(MRS)培养基在恒温条件下培养至少48h,酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基在恒温条件下培养24～48h,醋酸菌(AM)培养基在恒温条件下培养24～36h;倒置培养并隔一段时间进行观察；

b-2.挑取具有明显溶钙圈和酵母菌特征的菌落，再在乳酸菌通用(MRS)培养基、酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基和醋酸菌(AM)培养基上划线培养；

c.菌种筛选：

c-1.对疑似酵母菌的菌落直接水浸片镜检，对疑似乳酸菌菌落和疑似醋酸菌菌落进行革兰氏染色和显微镜下菌株形态观察，并选择具有典型酵母菌、乳酸菌和醋酸菌特征的菌株进行斜面保藏和甘油管冷藏；甘油管冷藏按菌液和甘油适宜体积比接入甘油管内，并冷藏于低温冰箱内；

c-2.对镜检未完全纯化的菌株，并重复以上步骤，再在乳酸菌通用(MRS)培养基、酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基和醋酸菌(AM)培养基上进行二次划线培养，然后按照所述步骤c-1进行菌种筛选；

步骤2:专用发酵菌种分子生物学鉴定：

(1)活化菌株提取：

选择典型的菌株，接种1环纯化后的酵母菌单菌落于酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)液体培养基中培养24～48h,得到酵母菌菌液；

醋酸菌单菌落接种于100mL的醋酸菌(AM)液体培养基中培养至少48h,得到醋酸菌菌液；

乳酸菌单菌落接种于100mL的乳酸菌通用(MRS)液体培养基中培养24h,得到乳酸菌菌液；

取2mL乳酸菌菌液于2mL离心管中，并分别将酵母菌菌液和醋酸菌菌液需按不同提