CN1869698A 马铃薯pvx、pvy、plrv、pvs病毒诊断试剂制作工艺方法 （黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所）.docxVIP

[19]中华人民共和国国家知识产权局

[12]发明专利申请公开说明书

[21]申请号200410044129.9

[51]Int.Cl.

G01N33/535(2006.01)G01N1/34(2006.01)

GO1N21/33(2006.01)

[43]公开日2006年11月29日[11]公开号CN1869698A

[22]申请日2004.12.17

[21]申请号200410044129.9

[71]申请人黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所

地址150086黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路368号

[72]发明人李学湛白艳菊吕典秋何云霞

胡林双于德才张儒喜马纪

[74]专利代理机构哈尔滨市哈科专利事务所有限责任公司

代理人刘庆吉

权利要求书8页说明书14页附图1页

[54]发明名称

马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法

[57]摘要

本发明涉及试剂，属于马铃薯PVX、PVY、PL-RV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法，其特点是：采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验，确定毒源材料。将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况，筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。

200410044129.9权利要求书第1/8页

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1.一种马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法，其特征是：病毒抗血清的制备如下：第一步搜集病毒分离用的指示植物；第二步采集病毒毒源，鉴定病毒种类；第三步指示植物分离并纯化病毒；第四步指示植物病毒扩繁；第五步马铃薯主要病毒的提纯；第六步病毒提纯液免疫家兔获得抗血清；第七步抗血清免疫球蛋白(IgG)的提取与浓度测定；第八步抗血清免疫球蛋的酶标记；第九步马铃薯病毒检测灵敏度测试；第十步免疫球蛋白与酶标免疫球蛋白的工作浓度测定；

实施路线

(1)马铃薯病毒的指示植物是：

表1马铃薯主要病毒繁育植物

病毒

繁毒植物

学名

马铃薯卷叶病毒PLRV

洋酸浆

Physalisfloridana

白花刺果曼陀罗

DaturaStramonium

马铃薯Y病毒PVY

洋酸浆

Physalisfloridana

马铃薯X病毒PVX

黄苗榆烟

Nicotianatabaco

马铃薯S病毒PVS

黄苗榆烟

Nicotianatabaco

(2)毒源采集

采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验，确定毒源材料。

(3)马铃薯主要病毒的分离、繁殖

将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离

200410044129.9权利要求书第2/8页

研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况，筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。

将分离纯化的马铃薯病毒一部分低温贮存，作为日后试剂盒制备的病毒毒源繁殖病毒以供提纯用。

病毒分离：

PVX:汁液摩擦接种，千日红——白花刺果曼陀罗——指尖椒——千日红——黄苗榆烟

PVY:汁液摩擦接种或蚜虫非持久性接种，洋酸浆——黄苗榆烟

PVS:蚜虫非持久性接种，千日红——毛曼陀罗——苋色藜——德伯尼烟

PLRV:蚜虫持久性接种，洋酸浆——白花刺果曼陀罗

(4)马铃薯主要病毒的提纯

以差速离心为基础，根据不同病毒特征，采用相应方法进行提纯。

1)几种病毒提纯路线

PVX病毒

寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，离心3,000-4,000rpm,20min

弃沉淀上清，离心10,000-12,000rpm,20min

弃上清沉淀+4%PEG缓冲液，搅拌