碱性磷酸酶触发荧光-比色双模式免疫检测赭曲霉毒素A的方法研究.pdfVIP

碱性磷酸酶触发荧光-比色双模式免疫检测赭曲霉毒素A的方法研究.pdf

摘要

赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）由曲霉属和青霉属菌株产生的次级代谢

产物，主要分布于农产品中。OTA具有剧毒性，致癌性和致畸性，且性质稳定不

易被降解，已被国际癌症研究机构（IARC）归为2B类致癌物，是目前对动物和人

类最具威胁的真菌毒素之一。

金纳米团簇（AuNCs）具有合成简单、稳定性高、荧光性能优异等优点，是一

种优良的荧光信号输出材料。由于聚集诱导和荧光共振能量转移（FRET），AuNCs

的荧光被Cr6+淬灭，通过还原Cr6+打开。因此，AuNCs在检测传感器中作为一种

荧光报告物，具有操作简单、响应迅速的优势。铈基纳米颗粒（CPNs（IV））作为

氧化酶可以在没有HO的情况下催化底物的氧化；被还原之后生成CPNs（III）

可以发出荧光信号。因此，CPNs（IV）在检测传感器中可作为一种荧光与比色报

告物。

本文首先建立了OTA的间接竞争酶联免疫检测方法（ic-ELISA），在ic-ELISA

的基础上结合碱性磷酸酶（ALP）触发AuNCs和CPNs（IV）构建OTA检测的新

型免疫传感平台，具体内容如下：

1.OTA间接竞争ELISA

基于辣根过氧化物酶标记IgG（HRP-IgG）催化3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）

显色，通过测量450nm处的吸光度值变化实现OTA定量检测，建立了OTA的ic-

ELISA检测方法。Y=41.754X-0.466，R=0.997。线性范围为2.34-64.57ng/mL，检

测限（LOD）为1.78ng/mL。检测玉米样品的回收率在96.88%-101.19%之间，符

合国际分析化学协会（AOAC）规定的回收率有效范围标准。

2.ALP触发AuNCs开启荧光免疫检测

由于FRET和AuNCs的荧光能被Cr6+淬灭。ALP催化抗坏血酸-2-磷酸盐

（AA2P）去磷酸化生成抗坏血酸（AA），AA还原Cr6+为Cr3+，同时AuNCs的荧

光被打开。通过测量480nm处荧光值的变化可实现对OTA定量检测。基于上述

原理建立了ALP触发AuNCs荧光开启的OTA免疫检测方法。OTA浓度的对数与

开启的荧光强度呈现良好的线性关系。线性方程为Y-1.871X+4.614，R=0.993。

线性范围是6.25-100ng/mL，OTA的LOD为0.693ng/mL。玉米样品中的加标回

收率在95.89%-101.08%之间，符合AOAC规定的回收率有效范围标准。表明所建

立的荧光免疫检测法对于样品中OTA的检测具有良好的可靠性与实用性。

3.基于CPNs（IV）的荧光-比色双模式免疫检测

ALP标记的IgG（ALP-IgG）可催化AA2P转化为AA。后者将CPNs（IV）还

原为CPNs（III），发出显著的荧光信号。残留的CPNs（IV）催化TMB氧化，形

成具有蓝色比色信号的oxTMB。基于上述原理建立了OTA的荧光-比色双模式免

疫检测方法。在荧光模式下，OTA浓度的对数与荧光强度在4.69ng/mL至37.50

ng/mL之间呈现良好的线性关系。线性方程为Y-140.302X+241.707，R=0.997，

LOD为0.404ng/mL。对于比色模式，OTA浓度的对数与吸光度（650nm）在14