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高效液相色谱分析法

一、高效液相色谱仪的结构与功能组成

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分别系统、检测系统和据处理系统，下

面将分别叙述其各自的组成与特点。

1.进样系统

一般采纳隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品

的重复性是有益的。

2.输液系统

该系统包括高压泵、流淌相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为1.47~4.4X107Pa,

流速可调且稳定，当高压流淌相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在

柱中的移动速度，这对提高辨别率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流淌相

贮存错和梯度仪，口使「流淌相随固定相和样品的性质而变甲，包括变更洗脱液的极性、离子

强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的

差别或是同分异构体）都能获得有效分别。

3.分别系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10〜50cm（须要两根连用时，

可在二者之间加•连接管），内径为2〜5mm,由“优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料

制成，住内装有直径为5〜10用】1粒度的固定相（由基质和固定液构成）.固定相中的基质是

由机械强度高的树脂或硅狡构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多

孔性（孔径可达1000）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定

相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或

各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好

的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素P（SA）后，就可以把成纤维细胞中的

种糖蛋白分别出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到称、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度

小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高辨别率是有益的。依据柱

效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高辨

利率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度，缩短分析时间，

就可增加层析柱的效率。

4.检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有汲取性能样品的检测。其特点：运用面广（如蛋白

质、核酸、氨基酸、核苜酸、多肽、激素等均可运用）；灵敏度高（检测卜限为

线性范围宽；对温度和流速变更不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

2（）示差折光检测器

凡具有与流淌相折光率不同的样品组分，均可运用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物

的检测大多运用此检测系统。这一系统通用性强、操作简洁，但灵敏度低（检测下限为

10-7g/ml）,流淌相的变更会引起折光率的变更，因此，它既不适用于痕量分析•，也不适用

于梯度洗脱样品的检测。

3（）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在肯定条件下，其放射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一

检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烧、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质

等）的测定，其灵敏度很高•（检测下限为10-12〜10-14g/ml）,痕量分析和梯度洗脱作品的检

测均可采纳。

5（）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分别、制备或鉴

定工作能正确开展。

二、液相色谱柱的正确安装和运用说明

液相色谱仪由岛・压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装

和运用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确牢靠的试验数据的必经之路。

（-）液相色谱柱的安装：

1、液相色谱柱的结构：

a、空柱由柱接头、柱管及片组装而成。

柱接头采纳低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端

是3/16英寸的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管①（6