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聚合酶链反应Polymerase chain reaction, PCR 一、什么是PCR？ PCR ——是一种模拟天然DNA复制的体外扩增DNA序列的技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。 三、PCR技术的原理 加热使双链DNA解开螺旋 ↓ 在退火温度条件下引物同模板DNA杂交 ↓ 在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物 ↓ 重复上述变性→退火→引物延伸过程至25-40个循环。 ★靶序列被扩增上百万倍(2n)，达到体外扩增核酸序列的目的。 四、PCR反应基本要素 1、DNA模板 来源广泛，容易获得； 模板用量较少； 标本纯度要求较低； 纯化方法较简便； 纯化目的：除去影响PCR反应的杂质，暴露模板DNA。 传统的DNA纯化方法： 采用去污剂破坏细胞组分，最后用有机溶剂去除蛋白质和细胞膜成分，蛋白水解酶消化去除蛋白质，用乙醇沉淀核酸。 快速的DNA纯化方法： 用高温低渗液体（如水煮沸）破坏溶解细胞，直接用于PCR扩增。 2、引物（Primer） 引物 ——是PCR特异性反应的关键。 △PCR的效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板DNA的特异结合；二是多聚酶对引物的有效延伸。 设计引物的总原则： ——提高扩增的效率和特异性。 引物设计基本原则 引物长度 ——一般以15-30bp为宜 引物扩增跨度 ——一般以200-500bp为宜 引物碱基分布 ——尽可能随机 引物碱基G+C含量 ——宜在45%-55%左右 引物内部不应形成二级结构 引物3’末端的碱基与模板DNA严格配对 3’末端的末位碱基最好选T、C、G，而不选A 引物5’末端的碱基没有严格的限制 引物中最好能加上合适的酶切位点 引物浓度：一般为0.1-0.5μmol/L，以产生所需要结果的最低引物量为好 3. 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 使用浓度为20-200μmol/L ——最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。 四种dNTPs的浓度应相同。 dNTP溶液具有较强的酸性，通常把dNTP配成5-10mmol/L贮存液，用NaOH调pH至中性，分装后-20℃冻存 。 4、Taq DNA聚合酶 最早用于PCR反应的酶是Klenow酶 缺点： 热稳定性差； 酶反应温度偏低。 现在都用Taq DNA聚合酶，具有良好的热稳定性。 浓度：1-2.5U/100μl时效果最佳。 目前主要有两种Taq DNA聚合酶供应： 5、Mg2+ Mg2+的作用： ——为DNA聚合酶活性所必需。 Mg2+的浓度： ——一般为1.5-2.0mmol/L，对应dNTP浓度为200μmol/L左右。 注意： ——所制备的模板DNA中不应含有高浓度的螯合剂如EDTA，也不应含有高浓度的带负电荷的离子基团，如磷酸根。 6、扩增反应缓冲液 最为常用的缓冲体系是10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8，20℃)。 反应混合物中50mmol/L以内的KC1有利于引物退火. 小牛血清白蛋白(100μg/ml)或明胶(0.01%)或Tween 20(0.05%-0.1%)有助于Taq DNA聚合酶的稳定。 在反应体系中加入适量（10%）二甲亚砜（DMSO）可减少模板二级结构，提高PCR反应特异性。 五、PCR反应循环参数 1. 变性温度与变性时间 一般情况下，94℃ 1min可使起始模板完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害。 退火温度影响着PCR反应的特异性，主要取决于引物的长度及G+C含量。 引物的长度在15~25bp之间时，退火温度可通过计算得到：Tm=4(G+C)+2(A+T) 温度： 建议选择在70-75℃之间，此时，Taq DNA聚合酶具有最高活性。温度过高不利于引物和模板结合。 时间： 根据待扩增片段的长度而定。72℃时核苷酸掺入率为35-100个核苷酸/秒。 循环次数决定着扩增程度。 在其它参数都已优化的条件下，最适循环次数取决于模板DNA的初始浓度。 在初使模板DNA为3×105，1.5×104，1×103和50拷贝分子时，其循环数可分别为25~30，30-35，35~40，40-45。 循环次数越多非特异性产物的量亦增加。 5、扩增反应曲线 理论上PCR扩增效率应为100% 在PCR反应的后期，由于(1)DNA聚合酶活性降低；(2)模板拷贝数大量增加；(3)引物及dNTPs量被大量消耗及模板互补链之间退火逐渐增加，→PCR扩增效率下降。PCR产物的指数形式增长也逐渐变为线性增长直至出现平台效应。 通过Y=A(1+R)n 式估算PCR产物的量。 六、结