稳定表达PTEN、EGFR、EGFRvⅢ人恶性胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定.docVIP

  稳定表达 PTEN、EGFR、EGFRv人恶性 胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定# 董裕翠，任欢** 5 10 15 （哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150081） 摘要：目的：分别建立稳定表达抑癌基因 PTEN、表皮生长因子受体（EGFR）及突变型 EGFRv 的恶性胶质瘤细胞系，从基因、蛋白及细胞水平验证外源性 PTEN、EGFR 和 EGFRv基 因对 U87MG 细胞的影响。方法：采用 PCR 方法扩增 PTEN 基因编码区序列，构建重组表 达载体 pcDNA3.1(-)/PTEN。分别将 pcDNA3.1(-)/PTEN 和 pLWERNL 转染 U87MG 细胞，筛 选后建立稳定细胞系。应用 RT-PCR 和 Western blotting 法检测 PTEN、EGFR 在不同抗性细 胞克隆的表达。MTT 法检测外源性 PTEN、EGFR 和 EGFRv基因对细胞增殖的影响。结 果 ： 构 建 真 核 表 达 载 体 pcDNA3.1(-)/PTEN 及 稳 定 表 达 细 胞 系 U87MG-PTEN 和 U87MG-EGFR，并经 RT-PCR 及 western blotting 验证。转染外源性 PTEN 抑制细胞增殖 （P0.05），转染 EGFRv促进细胞增殖（P0.05），转染 EGFR 对细胞增殖无显著影响 （P0.05）。结论：成功建立稳定表达抑癌基因 PTEN、原癌基因 EGFR 及其突变体 EGFRv 的人恶性胶质瘤细胞系。为进一步研究所转染基因对相关下游细胞信号转导通路的影响及 对恶性胶质瘤发生发展的作用打下良好基础。 关键词：恶性胶质瘤；PTEN 基因；EGFR 基因；EGFRv基因；稳定转染 中图分类号：R 20 Establishment and Identification of Human Glioblastoma Cell Line Stably expressing PTEN/EGFR /EGFRv Dong Yucui, Ren Huan (Department of Immunology, Harbin Medical University, Harbin 150081) 25 30 35 40 Abstract: Objective：To establish human glioblastoma cell line U87MG-PTEN, U87MG-EGFR and U87MG-EGFR stably expressing PTEN, epidermal growth factor receptor(EGFR) and EGFRvⅢ, respectively. On gene expression, protein expression and cell proliferation levels to verify the effect of exogenous PTEN, EGFR and EGFRvⅢ gene on the U87MG cells. Methods： The PTEN gene CDS was amplified by PCR , then inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-) to construct recombinant vector pcDNA3.1(-)/PTEN. pcDNA3.1(-)/PTEN and pLWERNL were transfected into U87MG cells respectively. The expression of PTEN and EGFR in different G418 resistant cell clones was detected by RT-PCR and Western blotting. The effect of exogenous PTEN, EGFR and EGFRvⅢ gene on the cell proliferation was tested by MTT assay. Results：The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)/PTEN was constructed. The stable cell lines U87MG-PTEN and U87MG-EGFR were established and verified by RT-PCR and Western blotting. Stable expression of exogenous PTEN can suppress the growth of human