在HepG2细胞中虫草素的降血脂作用机制研究.docVIP

  在 HepG2 细胞中虫草素的降血脂作用机制 研究# 苏岩1，郭鹏2** 5 10 15 20 25 30 35 40 45 （1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076； 2. 北京协和医学院，中国医学科学院药用植物研究所，北京 100093） 摘要：构建针对 AMPKγ 基因的 siRNA 慢病毒载体， 检测其介导的 RNA 干扰对人 肝癌细 胞株 HepG2 中 AMPKγ基 因表达的 沉默作 用； 并考察 AMPKγ 基因沉默对天然 AMPK 激 动剂虫草素激活 AMPK 和调节脂质合成的 影响。本 文设计并合成了特异针对 AMPKγ 基因 的 shRNA Oligo 片段， 经退火、 酶切、 连接将目 的片段插入到慢病毒干扰载体中， 经感受 态细胞转化、PCR 鉴定挑选阳性 克隆测序后，与 包装质粒和包膜质粒共转染至 293T 细胞包 装病毒， 收集浓缩病毒进行滴度测定。 通过荧光观 察和 Western blotting 筛选可有效沉默 AMPKγ 基因的 慢病毒株。 在 AMPKγ 基因稳定沉默细胞株中， 利用 Western blotting 考 察 AMPKγ 基因沉默对虫草素促 AMPK 磷酸化活性的 影响， 油红 O 染色， 观察虫草素对 细胞内 脂质堆积情况的 影响，试剂盒测定细胞内 TC、TG 含量。 结 果 表明， 成 功构 建了四 种特异针对 AMPKγ 基因的 慢病毒干扰载体（ GR084、GR085、GR086、GR087），Western blot 检测结 果 显示重 组慢病毒株 GR085 的基因沉默效率最高；给予虫草素并不 会影响 AMPK γ 蛋白的 表达，但能 够显著上调正 常细胞内 AMPK 蛋白的 磷酸化水平。利用 慢病毒稳定沉 默 AMPKγ 基因的 表达后， 虫草素促 AMPK 磷酸化作 用 和下调脂质合成作 用 被显著抑制。 研 究 表明， AMPKγ亚基 可能 与虫草素活化 AMPK 和调节脂质合成 作 用 相关 。 关键词：HepG2 细胞系； AMPK；慢病毒载体； RNA 干扰 中图分类号：R285.5 Study on the mechanism of cordycepin prevents hyperlipidemia in HepG2 cells SU Yan1, GUO Peng2 (1. Research Centre on Life Sciences and Environment Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076; 2. Peking Union Medical College,The Institute of Medicinal Plant Development, Beijing 100093) Abstract: The study is to confirm the silencing effiency of the vector in human hepat ocellular liver carcinoma cell line (HepG2), and observe effects of AMPKγ silencing on the AMPK situmulating activity and lipid synthesis of CCS, a natural product with known AMPK activating function. The downregulating efficacy of siRNAs on AMPKγ expression was confirmed in our previous study. The double stranded shRNA oligo was ligated to lentivirus vector and verified by sequencing. The lentiviral which can effectively inhibited protein expression levels of AMPKγ were select by western blot, and the regulation of CCS on protein expression of AMPKγ and p-AMPK in AMPKγ silence cells were detected by western blot analysis. The lipid accumulation in cells was observed by Oil-Red O stain and