免疫胶体金技术.ppt

【IGSS法优点】 1. 可被用于光镜和电镜观察 2. 敏感性高 3. 定位准确 4. 背景清晰, 对比度好 5. 方法简便, 安全 6. 成本较低, 标本可长期保存 (三) 彩色免疫金银染色法 Coloured IGSS, CIGSS 【基本原理】 组织切片经IGSS染色后, 抗原抗体反应部位生成的银颗粒通过铁氰化钾和溴化钾的作用, 使银原子被氧化生成金属银; 而彩色显影剂本身则被氧化, 其氧化产物使彩色剂由无色变为有色染料, 并沉积在银颗粒的部位, 而银颗粒被溶解 【优点】 特异性高, 彩色影象鲜明, 应用范围广 五. 免疫胶体金技术的特点 1. 胶体金制备简便 2. 标记简单 3. 特异性强 4. 敏感性高 5. 定位准确 6. 适应性广 7. 易于双重和多重标记 * * 免疫胶体金技术 Immunogold Technique 一. 概述 (一) 发展历史 1971年 Faulk和Taylon 用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合, 制备成金标抗体, 检测细菌表面抗原的分布 1975年 Horisberger等 把胶体金技术推广应用于扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究 1978年 Geoghegan 发表了胶体金标记物在光镜水平的应用 1981年 Danscher 建立了银显影液增强，光镜 下金颗粒可见性的方法 1983年 Moeremans等 在蛋白质转移电泳中应用了免疫金银染色法 1986年 Fritz等 在免疫金银法基础上成功进行了彩色免疫金银染色 免疫胶体金技术 以胶体金为标记物应用在免疫组织化学研究中，对细胞表面或细胞内的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位研究 （二）胶体金的基本概念 胶体金，一般指金的水溶液，又称金溶胶。 ---金以微小的粒子分散在水中所形成的金 溶胶。其中分散的金颗粒直径在1~100nm 之间。 二. 胶体金的制备 (一) 可用多种方法制备胶体金 分散法:包括机械分散法、超声波法、电分散法和胶溶法等 凝聚法:包括物理凝聚法、化学凝聚法（氧化法、水解法和还原法） 其中应用最多的是化学还原法 化学还原法 【基本原理】在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。在适当条件下，还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒，形成金溶胶。 【常用还原剂】柠檬酸钠、鞣酸、白磷等 柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，15~150nm 白磷还原制备的金颗粒直径较小，3~12nm 【具体制备方法】 （二）影响溶胶稳定性的因素 电解质 胶体金浓度 温度 大分子物质 （三）胶体金的鉴定 【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小及金颗粒的均匀程度 【鉴定方法】将胶体金滴在覆有Formvar膜或碳- Formvar膜的镍网上，空气干燥，透射电镜下观察，拍照，测量金颗粒的直径，并计算100个以上胶体金颗粒直径的平均值及标准差 （四）制备胶体金的注意事项 1. 玻璃器皿的清洁 2. 试剂配制 3. 影响胶体金颗粒大小的因素 玻璃器皿清洗→清洁液浸泡24h →流水冲→蒸馏水反复洗涤→晾干 应尽量使用分析纯试剂 各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制 加入还原剂的速度 搅拌是否均匀 制备胶体金所用的烧瓶大小 三. 胶体金探针的制备 (一) 胶体金与蛋白质结合的原理 胶体金标记蛋白质的过程, 实际上是蛋白质在等电点或稍偏碱时, 被吸附于胶体金颗粒表面. （二）胶体金的预处理 标记之前将胶体金的PH值调至待标蛋白质的等电点或略偏碱 调节PH的方法： 当需要提高胶体金的PH值时，用0.2mol/L K2CO3或0.1mol/L KOH 当需要降低胶体金的PH值时, 用0.1M HCL或醋酸 (三) 待标记蛋白质的处理 1. 透析除盐: 将蛋白质溶液装入透析袋中, 放 在蒸馏水中透析, 4℃过夜 2. 离心: 10000 r/min, 4℃, 1h, 去除蛋白质聚 合物等沉淀 (四) 胶体金蛋白质最佳结合率测定 不同直径的金颗粒, 及不同分子量大小的蛋白质, 其结合的比例是不同的 常用的检测二者结合量的方法有目测法和光电比色法 1. 目测法 先将待标记蛋白质逐级稀释 取一批小试管，编号