禽源与鼠源U6启动子对鸡马立克氏病病毒_gIgE基因shRNA干扰活性的比较论文.pptVIP

河北北方学院 毕业论文 禽源与鼠源U6启动子对鸡马立克氏病病毒 gI/gE基因shRNA干扰活性的比较 学生:吴习花 　引言 鸡马立克氏病由匈牙利兽医病理学家J.马立克于1907年首先发现，并用他的姓氏命名。简称MD，由疱疹病毒科中的血清I型马立克氏病病毒（Marek’ s Disease Virus，MDV）引起的一种疾病，以淋巴细胞组织增生，在各内脏器官以及外周神经、肌肉、以淋巴细胞组织增生，在各内脏器官以及外周神经、肌肉、皮肤中产生单核细胞浸润和肿瘤为特征。 1.4 讨论 1.4.1禽源U6和鼠源U6在不同细胞中表达siRNAs的效率 Paule等验证了RNA聚合酶III在所有类型的细胞都能表达，而且显示出较高的活力（Paule et al.，2000)；Yuan报道人源H1启动子在哺乳动物CHO细胞上的表达效率是禽源CEF和DT-40细胞的2倍，在沉默效率可能由于该类启动子不同而出现禽源细胞和哺乳动物细胞中相对优势差异（Yuan, et al.，2006）。 欢迎各位老师提出宝贵意见！ 谢谢！ * * RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA (double stranded RNA，dsRNA)介导、特异性地降解相应序列的mRNA，从而导致转录后水平的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)现象，具有高效性和高度特异性，已成为基因功能研究中的一种快速、简便的新方法。 MDV gI/gE基因有效siRNA不同来源的U6启动子 的活性比较 1.1 材料 1.1.1工程菌、细胞、质粒及毒株 DF1（鸡胚传代细胞系）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、MDCK（狗肾细胞传代细胞系）细胞由本实验室保存；禽源启动子构建的pcU6-shgI735和pcU6-shgE936, 鼠源启动子构建的pmU6-shgI735和pmU6-shgE936重组质粒由本实验室保存；报告质粒pEGFP-gI或pEGFP-gE由本实验室保存；pcU6-3-conshRNA和pmU6-conshRNA对照重组质粒由本实验室保存； MDVJ-1株、MDV-LZY分离株由本实验室存种。 1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM细胞培养基购于Gibco公司；氨苄青霉素（AMP）、卡那霉素（Kan）购于石药集团；胰酶购于Difico公司；质粒小量抽提试剂盒、胶回收和PCR产物回收试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司。 Beckman Coulter离心机（Beckman）, DYY-6C型及DYY-III2型电泳仪（北京六一仪器厂），eppendorf BioPhotometer 紫外分光光度仪BDFACSCalibur流式细胞仪(美国，Beeton-Diekinson公司)。 1.2 方法 1.2.1. 不同来源的U6启动子驱动siRNAs的转录活性比较 （1） 禽源U6和鼠源U6介导的pcU6-3shRNA和pmU6-shRNA重组质粒转染 我们将为了检测筛选出的siRNA对MDV糖蛋白E和糖蛋白I基因表达的影响，将纯化好的4种重组质粒pcU6-shgI735、pcU6-shgE936和pmU6-shgI735、pmU6-shgE936分别与报告质粒（pEGFP-gE或 pEGFP-gI）共转染DF1、MDCK、Vero细胞，以上不同细胞系按摸索的优化条件进行转染，其中转染的剂量为各重组质粒每孔200ng，报告质粒300ng 每孔。同时设pcU6-3-conshRNA和pmU6-conshRNA阴性对照，每种转染质粒设3个重复。测定干扰效率（(1-实验转染组融合细胞表达量/阴性对照组融合细胞表达量)×100%)，比较禽源（cU6-3）介导的特异性重组干扰质粒在不同细胞系内的基因干扰效果。 (2) 禽源U6和鼠源U6介导的siRNAs抑制gE -EGFP、gI-EGFP融合蛋白的表达 分别在转染后24、48、72h进行荧光显微镜观察，与pcU6-3-conshRNA或pmU6-conshRNA阴性对照组相比，定性观察转染细胞培养孔中的荧光强弱程度，在转染48h收集转染细胞，用D-Hanks 将细胞密度调整为105～106个细胞/ml，制成单细胞悬液，用流式细胞仪定量检测各质粒转染组中EGFP阳性细胞数。计算出抑制率，比较禽源U6和鼠源U6在不同种属来源的细胞系上驱动siRNAs的转录活性。 1.3 结果 1.3.1不同的启动子驱动siRNAs的效果评价 （1） 禽源U6和鼠源U6介导的siRNAs的活性比较 转染后48 荧光显微镜结果如图2-11所示： 与各自的阴性对照