第十一章_基因诊断与基因治疗.ppt

利用基因打靶技术，在基因置换的实验研究中已取得了一些进展。Oliver等利用基因同源重组的基因打靶技术将人的β-珠蛋白基因实现了定点整合。Capeehi等应用小鼠胚胎干细胞(ES)也实现了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因的定点重组。实现定点重组或整合的条件是转导基因的载体具有与染色体上的DNA相同的序列。这样，带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点进行部分基因序列的交换，以使基因置换这一基因治疗策略得以实现。 要实现基因置换，需要采用同源重组使相应的正常基因定位导入受体细胞的基因缺陷部位。定位导入的自然发生率约1／100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1／10。考虑到正常体细胞的生命周期，以及克隆筛选等实验给细胞生长带来的一系列问题尚未解决，因此用同源重组修复异常基因的方法进行遗传病的基因治疗只能作为远期目标。 基因添加或称基因增补(gene augmentation)是通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。基因添加有两种类型： 一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的正常基因整合到基因组中，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入的正常基因表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能； 二是向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。例如，将细胞因子基因导入肿瘤细胞进行表达，即属于这一类型。 基因添加与基因置换一样，也必须具备上述5个必要条件。 (三)基因添加 基因干预(gene interference)是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。较常用的方法是采用反义核酸或反义核酸加核酶，抑制基因的表达。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒的基因。 (四)基因干预 基因治疗的方式有两种：第一种是体内直接转基因，称为体内法，这是最有前途的方式，也是各种基因转移技术集中攻关的方向。但目前仍存在转移和表达效率低等困难。现已在腹腔、静脉、动脉、肝、肌肉、气管、乳腺及脑等多种组织器官获得成功。第二种是细胞介导的基因治疗，称为回体法，即先将合适的靶细胞在体外进行增殖，将外源基因导入细胞内使其能高效表达，然后再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使外 三、基因转移技术和靶细胞 源基因在体内表达，从而达到治疗目的。这是目前最常用的方式，所使用的靶细胞既有细胞株也有原代细胞。 无论采用何种方式，基因治疗都必须通过适当的基因转移(gene transfer)技术将外源基因转移至特定细胞内。基因转移技术有两大类：生物学方法和非生物学方法。前者主要是利用载有外源基因的缺陷病毒感染受体细胞，后者是通过物理或化学方法将DNA导入细胞。两类方法各有千秋，每一类的各种方法也有各自的特点，使用上也有一定的侧重。 1、逆转录病毒载体的结构 常用的逆转录病毒载体是从小鼠白血病病毒（Mo-MLV）的前病毒（DNA）制备的。同所有逆转录病毒一样，该病毒基因组可分为两类组分：一是编码病毒功能蛋白的结构基因gag、pol、env，也称为反式功能区；二是复制、整合、RNA转录及包装所必须的顺式作用区。 （一）基因转移的生物学方法 （以逆转录病毒载体为例） 逆转录病毒载体是基因治疗中最常用的载体。 gag env pol 逆转录病毒（9.8Kb） LTR LTR ψ Ψ：包装信号序列 LTR：长末端重复序列 将前病毒DNA中编码功能蛋白的基因切除，而保留顺式作用区，并将其插入质粒，即构成了逆转录病毒载体。在前病毒区插入了一个抗性标记基因，供阳性筛选用。 3′ Neo 5′ Ampr ori E LTR LTR ψ cDNA 插入外源 （ ） 转染包装细胞， 转录出RNA RNA 在包装细胞中包装成假病毒 逆转录病毒载体 2、包装细胞 包装细胞（packaging cell）系是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装，不产生病毒颗粒。 3、逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒载体转变成假病毒颗粒后，假病毒颗粒中所包含的RNA与逆转录病毒基因组的结构相似，实际上只是以目的基因和标记基因取代了病毒的结构基因。感染靶细胞的过程与普通逆转录病毒一样。 ①斑点杂交或狭缝杂交：将放射性核素标记的DNA探针与点在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的待测RNA进行杂交，经放射自显影后进行吸光度扫描，通过正常对照与待测标本的比较可以确定待测RNA表达量的高低。 （1）mRN