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第十章 转基因动物技术 刘智敏 第一节 转基因动物 一、概述 转基因动物（transgenic animal）是指用人工方法将外源基因导人或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，其特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。 自1981年，美国的Brinster和Palmiter 获得世界上第一只转基因动物—“巨鼠”以来，国内外对转基因动植物的研究方兴未艾。到目前，我国也已获得了转基因鼠、转基因鱼、转基因猪、转基因羊、转基因鸡等多种转基因动物。 转基因动物的基本原理是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植人受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。 转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的转录单位）。由于哺乳类动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引人报告基因(reporter gene)或报告序列(reporter sequence)。顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强启动子（有时包括增强子), 或者直接选用目的基因的天然启动子序列。 三、转基因动物的基本方法 1.显微注射法 （microifljection） 显微注射是目前最常用的转基因方法之一，其基本原理是用显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的原核，使外源基因整合到实验动物基因组中，从而得到转基因动物。优点是：导入基因的速度快且操作简单，对DNA大小无限制（最大已达250kb）。 转基因动物的一般实验程序 2.胚胎干细胞法 （embryonic stem cells， ES细胞）胚胎干细胞是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。由于它注射入动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此，可将其作为一种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物。ES细胞可通过磷酸钙-DNA共沉淀法、逆转录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。 将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其转染包装细胞，这时，既可以收获重组病毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细胞培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。 通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源DNA的精子，然后利用其进行受精，将外源DNA导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源DNA的转基因个体。 5.转基因动物中外源DNA的检测 染色体和基因水平Southern 杂交、FISH、 PCR等 转录水平 Northern 杂交、RT-PCR等 蛋白质水平 Western blot 四、转基因动物的应用 ①对基因组织或阶段特异表达的研究；②通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能；③导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，可以发现新的基因；④可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究； ⑤建立研究外源基因表达、调控的动物模型； ⑥对遗传性疾病的研究；⑦建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；⑧动物新品种的培育；⑨基因产品的制备；⑩在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。 五、已建立的人类遗传病的转基因动物模型 第二节 基因打靶 基因打靶（gene targeting）是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活动内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（gene knock-in）。目前这种技术主要在小鼠ES细胞中进行。 一、基因打靶的必备条件 1.胚胎干细胞 ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5大的胚泡细胞。ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。ES细胞体外贴壁生长时的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列紧密，呈集落样生长。 2.打靶载体 打靶载体含有两种筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV－tk阴性筛选标志,通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳性率。 （1）neo阳性筛选标志：将neo基因插