单增李斯特菌iap、actA、plcB基因的原核表达、产物的免疫原性分析以及重组p60蛋白多抗的制备.pdfVIP

暨南大学硕士论文 LM iap、actA、plcB基因原核表达，产物免疫原性分析及 p60多抗制备 摘 要 目的：单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是李斯特菌属最重要的人和动 物致病菌，由于其具有低温生长的特性，因此是冷藏食品和即食食品最重要的致 病菌之一。本文通过原核表达单增李斯特菌特异性膜表面蛋白的基因 iap，actA， plcB，并分析其产物作为制备 LM 特异性膜表面蛋白单克隆抗体的可行性，为今 后制备这些蛋白的单克隆抗体并建立单增李斯特菌的免疫学磁珠分离快速检测 方法的建立奠定基础。 方法：分别设计 actA，plcB，iap基因引物，并以提取的单增李斯特菌 DNA 为 模板进行 PCR扩增，产物回收后，连接入 pMD18-T克隆载体，转化 E.coliDH5α， 提取质粒并进行双酶切鉴定及测序鉴定。鉴定正确的的重组质粒与表达载体 PET28a(+)/PET32a（+）构建重组表达质粒，产物转化 E.coliBL21，经含卡那霉 素/氨苄青霉素的 LB培养基筛选，挑取阳性菌落并进行测序。将鉴定正确的菌液 ITPG诱导表达，超声破碎菌体，SDS对表达产物进行可溶性表达分析， 利用亲和层析分离纯化目的蛋白，运用 westernblotting和 ELISA分析重组蛋白的 免疫原性，将纯化的 p60蛋白免疫小鼠，制备鼠多克隆抗体，ELISA检测效价以 及交叉反应性。 结果：双酶切及测序鉴定显示，重组克隆载体及表达载体均构建成功。分析诱导 表达产物，ActA蛋白和 p60 蛋白为可溶性表达，plcB 为包涵体表达。镍离子亲 和层析纯化，得到了纯度较高的 PlcB 蛋白和 p60 蛋白，但是 ActA 没有纯化成 功。免疫原性分析表明：p60蛋白和 ActA蛋白与兔和鼠免疫血清均具有反应性， plcB 与兔免疫血清反应良好。以重组表达的 p60 蛋白作为免疫原制备鼠多克隆 抗体，3次免疫后效价达到 1:8000，并且与属内威尔斯、英诺克菌存在微弱交叉 反应。 结论：原核表达单增李斯特菌毒力因子基因 actA，plcB，iap，分析了所表达蛋 白的免疫原性，其中重组 p60蛋白对于家兔和小鼠均有较好的免疫原性，免疫小 鼠后所得多抗与 LM 菌体特异性结合，这表明以其为靶点，制备 LM 特异性的膜 表面单抗是可行的。 p60 ActA plcB p60 ActA plcB 关键词：单增李斯特菌 免疫原性 pp6600 AAccttAA ppllccBB I 暨南大学硕士论文 LM iap、actA、plcB基因原核表达，产物免疫原性分析及 p60多抗制备 Abstract Abstract AAbbssttrraacctt Objectives: Objectives: OObbjjeeccttiivveess:: Listeriamonocytogenes(LM) is the most important bacterium in Listeria sppbecause it can cause severe food-borne infections in humans and animals，It can grow in the temperature as low as 4℃，so LM is one of the most virulent strains in Ready-to-eat food and frozenfood．The infection ofLM involves avariety of virulent such as LLO、ActA、plcA/B、p60、PrfA、Internalin and P104.In thispaper，we cloned and prokaryoticly expressed p60 、 Act