实验四细胞骨架观察.pptVIP

实验七亚细胞结构的观察- 细胞骨架的观察 真核细胞中错综复杂的纤维网架，称为细胞骨架（cytoskeleton） 。 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。 狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括： 微丝（microfilament，MF，7nm） 微管（microtubule，MT，25nm） 中间纤维（intermediated filament，IF，10nm） 细胞骨架（cytoskeleton） 细胞骨架的主要功能 微丝（microfilaments） 微丝骨架是细胞内高度动态的结构, 包括微丝的聚合、交联、成束及解聚等形态变化. 在细胞执行各种运动功能或对外界刺激发生反应时, 微丝骨架常常通过迅速地聚合与解聚来调整与改变其形态结构, 从而维持细胞正常生理活动的进行微丝骨架在维持细胞形态、参与细胞运动、胞质分裂和极性建立等细胞生理活动中扮演重要角色 。 G-actin、F-actin 单体肌动蛋白（G-actin）和丝状肌动蛋白（F-actin）的相互转变是微丝骨架的功能基础。 肌动蛋白是微丝的结构成分，相对分子质量是4.3×104，有三种异构体，即α-actin、β-actin和γ-actin。 比较传统的模型认为微丝是由两条肌动蛋白单链呈右手螺旋盘绕形成的纤维，近年来有些学者认为微丝是由一条肌动蛋白单体链形成的右手螺旋 G-actin F-actin F-actin G-actin F-actin G-actin F-actin ATP、 Mg2+、高K+、Na+ Ca2+、低Na+、K+ treadmilling model 微丝标记方法 微丝标记分为在固定细胞中标记微丝和活体细胞中标记微丝。 固定细胞中的微丝主要是用带荧光探针的抗体或鬼笔环肽标记，需要对样品进行化学固定和膜的通透。 上皮细胞中的应力纤维（微丝红色、微管绿色） （图片来自/） 活体标记 荧光类似物标记： 指结合荧光探针的蛋白或多肽通过显微注射的方法转入细胞质中，参与微丝的组装或结合微丝从而展现细胞骨架的重建。 GFP融合蛋白标记： GFP直接和肌动蛋白融合 GFP和全长或截短的肌动蛋白结合蛋白（ABP）融合 细胞骨架研究中常用药物 药物名称 作用 细胞松弛素B (cytochalasin B, CB) 结合在微丝的正端，阻抑其聚合，同时提高临界浓度，最终导致微丝的解聚 鬼笔环肽 (phalloidine) 强烈亲和微丝，结合在微丝中actin亚单位之间，稳定微丝、促进微丝聚合 秋水仙素（colchicine） 阻断微管蛋白组装成微管 紫杉酚（taxol） 促进微管的装配，稳定已形成的微管 实验原理(一) S.D.Pone用考马斯亮蓝染人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。 当细胞用适当浓度的triton X -100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容易被去除 ，经固定和考马斯亮兰（非特异性蛋白质染料）染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。 实验原理(二) 鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。 由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法. 实验目的 掌握细胞骨架的显示方法 了解光镜下细胞骨架的基本形态结构 材料和试剂 材料： 2BS人胚肺细胞、 CHO中国仓鼠卵巢细胞 、 人肺癌A549细胞 试剂： PEM缓冲液（50 mM pipes （pH 6.9）,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 ），0.5 % Triton X-100 （溶于PEM缓冲液），4%多聚甲醛（溶于PEM缓冲液），0.2％考马斯亮蓝R250， 55nM Alex -phalloidin 取出盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL) 2BS细胞、 CHO 、 A549细胞培养于小盖玻片上（爬片） 实验步骤 Triton X-100处理约10min(1mL) 37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL) 37℃预温 4%多