重组人和大鼠醇脱氢酶、醛酮还原酶的克隆表达及应用.pdfVIP

778 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2009, 44 (7) : 778784 重组人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的克隆表达及应用 1 1, 2 1* 高凌波 , 王金朝 , 曾 苏 ( 1. 浙江大学药学院药物分析与代谢研究室, 浙江 杭州 310058; 2. 浙江华海药业股份有限公司质量控制部, 浙江 台州 317024) 摘要: 克隆、表达人和大鼠醇脱氢酶 (ADH) 、醛-酮还原酶 (AKR) 基因全长cDNA, 研究扁桃酸 (MA) 代 谢机制。设计引物, 利用RT-PCR 克隆人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶基因全长cDNA 。测序正确的cDNA 被 克隆到表达载体pET-28a (+) 上并在大肠杆菌BL21 (DE3) 中稳定表达。利用亲和色谱纯化相应的酶, 通过检测 其在340 nm 吸收度 的变化进行酶活性测定。获得的醇脱氢酶与扁桃酸, 醛-酮还原酶与苯乙酮酸 (PGA) 共孵 育, 采用HPLC 分析其代谢和转化情况。通过测序, 目的蛋白的cDNA 序列完全正确, 在宿主菌中获得良好的可 溶性表达, 经Ni2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯, 具有较好的催化活性。人ADH2 对扁桃酸的代谢具有立 体选择性, 优先代谢S-MA, 对S-MA 的代谢能力较强。大鼠ADH1 对扁桃酸无代谢活性, 人和大鼠AKR 对苯乙 酮酸均无代谢。成功构建人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的表达质粒, 获得高活性的蛋白。这些重组酶模型可 以用于由醇脱氢酶和醛-酮还原酶介导的药物代谢研究。 关键词: 乙醇脱氢酶; 醛-酮还原酶; 扁桃酸; 立体选择性代谢; 手性转化 中图分类号: R963 文献标识码:A 文章编号: 05 13-4870 (2009) 07-0778-07 Cloning, expression and the application of human, rat alcohol dehydrogenase and aldo-keto reductase 1 1, 2 1* GAO Ling-bo , WANG Jin-zhao , ZENG Su (1. Dep artment of Pharmaceutical Analysis and Drug M etabolism, College of Pharmaceutical Sciences, Zhej iang University, Hangzhou 310058, China; 2. Depa rtment of Quality Control, Zheji ang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd, Taizhou 317024, China) Abstract: This study is aimed to clone and express human, rat alcohol dehydroge