质谱技术研究海兔大脑神经节超微量多肽.pdfVIP

维普资讯 第34卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 特刊 2006年9月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry $95～$99 质谱技术研究海兔大脑神经节超微量多肽 内切酶和酸性多肽酶解产物 林庆梅 。 黄慧英 黄河清 1,3 蔡宗苇， (。厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室； 海洋与环境科学学院国家近海海洋环境科学国家重点实验室； 化学化T学院固体表面物理化学国家重点实验室，厦门361005) 摘 要 采用ESI—Q—TOF质谱分析了南27个氨基酸残基组成的酸性多肽 (AP)的一级结构。选用 RPHPLC 和MALDI—TOF质谱非在线技术分离与鉴定海兔大脑神经节 (CG)多肽与蛋白质的组成与分布，发现CG巾含 有AP酶解的二聚体短肽 这些短肽序列分别为2(NKDEEQRELLKAIsNLL)、2(NKDEEQRELLKAIsNL)、 2(SGVSLLTSNKDEEQREL)和2(LTSNKDEEQRELL)，均以L—R(氨基酸残基)方式断裂 ．以AP为探钊 ，结 合MALDI—TOF质谱分析技术，发现CG中含有超微量的L—R多肽内切酶 ，其分子量为78218。25Da。木研究 中的分析方法也适合于研究其他生物体内超微量多肽及多肽酶分布与功能。 关键词 海兔，大脑神经节，酸性多肽，二聚体 ，多肽内切酶 引 言 海兔(印 ia)主要分布于沿海浅海区域，属于腹足纲类的软体动物。由于海兔的中枢神经系统 (centralnervOllSsystem，CNS)结构简单，易分离和细胞定位，因而它的CNS一直是神经分子生物学的经 典比对模型_】 。目前有关海兔CNS蛋白质与多肽组的分离、纯化与鉴定研究甚少，其原因是缺少可行 性分离与纯化 CNS多肽与蛋 白质组的方法 I。Rubakhinl4曾采用 MALDITOF质谱技术直接分析加洲 海兔 (AC)囊细胞(bagcel1)外表层多肽组成与分布，并发现了酸性多肽(AP)组成。Hummon等 发现 了AC口腔神经节中含有酶切AP(一级结构：SSGVSLLTSNKDEEQRELLKAISNLLD)L—L酰胺键的多肽 酶。近期，作者也发现了海兔CG外表层含有AP的酶解产物，推测酶解顺序是从 AP的N端到C端 ，并 以L-R方式酶解 APJ。吴韩志等 采用MALDI-TOF质谱技术研究厦门蓝斑背肛海兔(NLCS)CNS连 索外表层超微量多肽组成与分布时，也发现了神经连索外表层上含有 AP酶解产物祠．1聚合态 }}I于海 兔CNS的AP、AP酶解产物和多肽内切酶含量很微，难于采用常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PA(；E)方法 给予分离与纯化，从而限制了对分子结构的研究。 本实验采用 RP—HPLC和 MALDI—TOF质谱分析技术，分离与鉴定海兔大脑神经节 (cerebral ganglion，CG)中超微量AP酶解产物的组成与结构；以AP为探针和MALDI-TOF质潜为分析技术，研究 海兔 CG中多肽内切酶的功能，进而研究AP的生理功能。 2 实验部分 2．1 试剂与仪器 酸性多肽 (AP)纯度为98％；2，5一二羟基苯甲酸(DHB)(美国ICN生物医学公司)；一l氟乙酸、乙腈 (纯度为99％)和冰醋酸等均为分析纯。其余试剂均为美国Sigma公司产品。 BioTOF—Q型HPLC-ESI—Q—TOF质谱仪 (德闰Burker公司)和 VoyagerDE—STRMALDI—TOF质谱仪 (美国应用生物系统)；二元双泵HPLC(美国MichromBioresources公司)；多肽一一级结构分析软件 (P s 公司产品)。 2．2 实验方法 2005—10—2l收稿 ；2())(6_01．23接受 本文系国家 自然科学基金 (No、福建省 自然科学基金 (No，C0310006)和厦 门大学预研 孳盒 (No．2004x(hx207 Noxdkjc资助项