自我失活型逆转录病毒载体在衰老基因转录调控中的应用.pdfVIP

2002 ; 29 ( 1) 　　　　 生物化学与生物物理进展 　　 Prog. Biochem. Biophys. ·83 · 自我失活型逆转录病毒载体在衰老基因 转录调控中的应用 汪 　维 　吴军峰 　张宗玉 　童坦君 (北京大学医学部生物化学与分子生物学系 , 北京 100083) 摘要 　以自我失活型逆转录病毒载体pSIR 为基础 , 构建了含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的载体 pSIREGFP 和含有 870bp p16 启动子载体pSIREGFP870. 将两种病毒载体转染至包装细胞包装成病毒颗粒. 病毒感染 2BS 靶细胞 , 病毒 5′L TR 在逆转录过程中自我灭活. 通过该系统观察到 p16 启动子在 2BS 细胞衰老过程中 , 转录活 性明显增强. 结果表明 , 自我失活型逆转录病毒载体能很好地用于衰老基因转录调控的研究. 关键词 　自我失活, 逆转录病毒 , 衰老 , 基因转录调控 学科分类号 　Q753 , Q343 　　近年来 , 随着人们对衰老问题的研究不断深 12 　方法 入 , 越来越多的衰老相关基因相继被克隆和分 12 1 　重组逆转录病毒载体的克隆 : 以 Af l Ⅱ酶切 离[1 ] . 对于一些重要的衰老相关基因 , 特别是与 pEGFP1 , 补平后再以 Sal Ⅰ酶切, 电泳分离10 kb含 细胞生长和细胞周期调控密切相关的基因转录调控 EGFPSV40polyA 片 段. 将 该 片 段 亚 克 隆 到 的研究 , 有助于深入理解衰老的分子机理. 体外培 pBluescript Ⅱ之 EcoR Ⅴ和 Sal Ⅰ位点. 以 EcoR Ⅰ和 养的人成纤维细胞是研究人体细胞衰老的重要模 Bam H Ⅰ酶切, 并回收 EGFPSV40polyA 片段部分. 型[2 ] . 人成纤维细胞特别是衰老的成纤维细胞转 将其插入到pSIR Eco R Ⅰ和B am H Ⅰ位点, 得到含 染效率低下 , 是研究细胞衰老过程中基因转录调控 EGFPSV40polyA 的逆转录病毒载体 , 命名为 的一大难题. 因此 , 目前有关衰老基因转录调控的 pSIREGFP. 以 Eco R Ⅰ和 Hin d Ⅲ酶 切 p16 文章罕见报道. 本文以体外培养的人二倍体成纤维 promoterLuc , 分离 A TG 上游 870 bp p16 启动子 细胞为研究对象 , 以增强型绿色荧光蛋白为报告基 片段. 亚克隆到 pCDNA3 1 Eco R Ⅰ和 Hin d Ⅲ位 因 , 探讨和评价了自我失活型逆转录病毒载体在衰 点. 以 Xho Ⅰ和 Hin d Ⅲ酶切 , 回收 09 kb 之 p16 老基因转录调控研究中的应用. 启动子 ,插入到pSIREGFP 载体 EGFP 上游 Xho Ⅰ 和 Hin d Ⅲ位点 ,命名为 pSIREGFP870 ( 图 1) . 1 　材料和方法 12 2 　用脂质体介导重组逆转录病毒载体转染 11 　材料 PT67 细胞包装产生逆转录病毒 : 待转染的 PT67 111 　细胞系 : 2BS 细胞 , 人胚肺二倍体成纤维 细胞培养至占培养皿表面积 60 % 时 , 参照 细胞