巨噬细胞的分离和纯化巨噬细胞的分离1）从小鼠、豚鼠或.pdfVIP

中国试剂网 3.8.8.65 巨噬细胞的分离和纯化 巨噬细胞的分离 1）从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞 1．取6 周左右的小鼠 （或600 克左右的豚鼠，或3 公斤左右的家兔），剃去腹部 的毛并消毒。腹腔注射1ml （豚鼠20ml ，家兔200ml ）无菌的液体石蜡或巯基乙 酸肉汤或4 ％淀粉肉汤。3～4 天以后收集腹腔细胞。 2 ．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。放血处死 动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml （豚鼠20～40ml ， 家兔50～70ml ）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS ）。 轻轻按摩腹部5 分钟。 3 ．以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H 冲洗腹腔2～3 次。合并渗出液于离心管中，4 ℃离心250 ×g 10 分钟，去上清液。 4 ．用预冷的RPMI-1640 培养液洗涤细胞3 次，每次4 ℃离心250 ×g 10 分钟， 去上清液。用预冷的适量RPMI-1640 培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并 决定细胞活力。 2 ）家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化 1．取 2～3 公斤重的家兔，耳缘静脉注射 10ml 空气处死动物或注射 2ml （含 130mg）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无 菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和 结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。 2 ．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml 无菌的 冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管， 将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml 无菌冷生理盐水冲洗肺泡， 合并浸出液，置4 ℃。 3 ．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在 有冷RPMI-1640 培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640 培养液的 20ml 注射器接23 号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气 管树全部分离。使肺组织通过200 目的钢丝网，分离单个细胞。 中国试剂网 3.8.8.65 4 ．以下过程均在 4 ℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞： 离心200 ×g 10 分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/L Tris, 0.75 氯化铵，pH7.4 ），37℃处理3～5 分钟，溶解红细胞。红细胞通常分 别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1％和10％。也可以不用低渗处理，直接在 淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。 5 ．离心200 ×g 10 分钟，去上清液。用RPMI-1640 培养液洗涤细胞一次。将细 胞悬液加在淋巴细胞分离液 （比重1.077）上，离心400 ×g 20 分钟，收集交界 面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。 6 ．用RPMI-1640 培养液洗涤巨噬细胞2 次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数， 将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达 90 ％以上，巨噬细胞占全部细胞 的90 ％以上。 3 ）从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞 1．用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷RPMI-1640 培养液 （含 1％小牛血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪。用无菌注射器芯将脾脏或胸腺 挤压通过200 目的钢丝网，获得单个细胞。 2 ．离心200 ×g 10 分钟，去上清液。用含1％小牛血清的RPMI-1640 培养液将 细胞配成约1×108～5 ×108/ml。 巨噬细胞的纯化