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免疫球蛋白的分离纯化及鉴定 院系：生物与环境学院 专业班级：生物技术061 学生学号学生姓名: 杨一文 指导老师姓名: 汪财生 职称：教授 起止时间：2008年12月8日起 2008年12月13日止 实验设计方案 实验目的 学习从血清中提取免疫球蛋白； 掌握G-25凝胶层析柱的原理和操作方法； 掌握DEAE-离子交换剂纯化血清IgG的实验方法； 学习福林-酚试剂测定蛋白质浓度； 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量的操作方法和计算蛋白质的分子量。 实验原理 盐析作为一种重要的沉淀手段，在实验室中常被用来分离纯化蛋白质，特别是对原料的初步分离。蛋白质在水中的溶解度取决于蛋白质分子的水合程度，利用添加无机盐的办法改变蛋白质的水合程度，可造成蛋白质的沉淀。由于各种蛋白质表面极性基团的数目和分布不同，随着无机盐加入量的增加，不同蛋白质在析出顺序上具有先后差异，因此通过控制无机盐的加入量，以分级沉淀的方式，实现蛋白质的分离纯化。 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。再根据交换吸附于固定相上的各组分解离度的差别，运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。 离子交换层析中的固定相称为离子交换剂。它是由在不溶性高分子母体上引入不同的可解离基团所构成。常用的不溶性高分子母体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖及人工合成的树脂等。引入于母体上的活性基团主要有酸性或碱性物质。由于引入的酸性物质可解离出H+离子，能与液相中的阳离子交换，故这类离子交换剂称为阳离子交换剂；引入的碱性物质可解离出OH－离子，能与液相中的阴离子交换，故将这类离子交换剂称为阴离子交换剂。名称 ?????????型号 ????????????厂家 ?? 90-2 ?????? 上海亚荣生化仪器厂 自动液相色谱分离层析仪???? MC99-3 ???????? 上海沪西分析仪器厂 紫外可见分光光度仪????? S53 ???????? ? 上海棱光技术有限公司 循环水式多用真空泵 SHB-III?????? 郑州长城科工贸有限公司 直流稳压电泳仪 ?DYY-III-4型???? 北京六一仪器厂 垂直电泳槽 ?????? VE-180 ? 宁波海力生化实业有限公司 紫外透射反射仪 ??????? ? WFH-201B?????????? 上海精科实业有限公司 高速台式冷冻离心机 5804R eppendorf 德国进口 微琼脂糖电泳仪 BG-VERMINI 北京百晶生物技术有限公司 酸度计 PB-10 北京赛多利斯仪器系统公司 通风柜 TF-12.15.18 深圳美加丽室实验装潢公司 恒温磁力搅拌器 Feb-90 上海亚荣生化仪器厂 玻璃仪器气流烘干器 星火牌E型 郑州长城工贸有限公司 表实验主要仪器一览表名称 ???????????? 规格??????????? 出产?厂家 Sepharose?生物公司 SDS十二烷基磺酸钠 进口试剂标准 BIO-RID生物公司 丙烯酰胺 进口试剂标准 Sepharose?生物公司 表2 实验试剂一览表 部分仪器与试剂操作要点 台式冷冻离心机离心前务必要进行平衡，以防不平衡离心损坏离心机； 紫外可见风光光度计使用钱要预热20分钟，石英比色皿的使用要注意配套； 电泳槽的电极拔出时候要防治橡皮圈脱落，否则缓冲液会漏出； 色谱仪配套的层析柱子的两端橡皮圈要注意保管以防遗失造成漏液； DEAE离子交换剂和G50凝胶都是贵重药品，要注意使用后的回收再利用； 丙烯酰胺称量时候要戴手套和口罩，并在通风厨中进行，以防中毒。 第 4 页