靶向性腺病毒载体介导凋亡素基因对人结肠癌细胞的影响.pdfVIP

摘 要 目的：构建由癌胚抗原启动子（pCEA ）控制凋亡素基因(VP3)表达的重组腺病毒载体（Ad- CVP ），探讨其对人结肠癌细胞的靶向性致凋亡作用。 方法：应用PCR 扩增获得pCEA 、VP3-PolyA （凋亡素基因与连接在其后的多聚腺苷酸）， 再通过重叠PCR 使二者拼接成pCEA-VP3-PolyA 片段(简称CVP)，将CVP 片段克隆入腺 病毒穿梭质粒pAdtrack 中，构成转移质粒pAdtrack-CVP ，与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1 共 转化大肠杆菌BJ5183 ，筛选出重组质粒pAd-CVP ，将获得的重组质粒pAd-CVP 经pacI 线 性化后转染HEK293 细胞，包装出病毒颗粒。对重组腺病毒进行扩增、纯化、滴度测定。 重组腺病毒Ad-CVP 分别感染人结肠癌细胞LS 174T （CEA 表达阳性）、HEK293 细胞（CEA 表达阴性）、Hep G2 肝癌细胞（CEA 表达阴性），另设PBS 及对照病毒感染人结肠癌细胞 作为阴性对照。再分别通过RT-PCR 、WESTERN BLOT 分别从mRNA 水平和蛋白水平检 测VP3 的表达。通过Hoechst33258 染色对细胞凋亡进行定性检测。采用流式细胞术对细 胞凋亡率进行定量检测，比较重组腺病毒感染不同细胞后其凋亡的差异。 结果：酶切和测序鉴定结果显示，正确克隆出pCEA 、VP3-PolyA 片段，CVP 片段拼接成 功，CVP 片段被正确克隆入腺病毒穿梭质粒pAdtrack 中，并成功构建了重组质粒pAd-CVP 。 将其线性化后转染 HEK293 细胞，成功包装出重组腺病毒 Ad-CVP 。测定病毒滴度为 1.5 11 ×10 pfu/ml 。Ad-CVP 感染人结肠癌细胞LS 174T 、HEK293 细胞及Hep G2 肝癌细胞24 小时后，RT-PCR 检测及WESTERN BLOT 检测显示人结肠癌细胞LS 174T 检测到凋亡素 基因的mRNA 、蛋白的表达，而其余两种细胞中则无表达。PBS 组及对照病毒组亦未检测 到凋亡素基因的 mRNA 、蛋白的表达。通过 Hoechst33258 染色检测显示仅人结肠癌细胞 LS 174T 出现凋亡形态改变，其余两种细胞及PBS 组与对照病毒组则无凋亡形态改变。流 式细胞仪检测显示，Ad-pCEA-VP3 感染人结肠癌细胞LS 174T 、HEK293 细胞及Hep G2 肝癌细胞18 小时后，三种细胞的凋亡率分别为： 36.9%±2.1% ，5.3%±1.3%，4.9%±0.9% 。 人结肠癌细胞LS-174T 的凋亡率明显高于其他两种细胞（P0.05 ）。 结论：由pCEA控制VP3表达的重组腺病毒载体Ad-CVP对CEA表达阳性的结肠癌细胞具有 靶向性致凋亡作用。 关键词：凋亡素；腺病毒载体；凋亡；靶向性；结肠癌细胞。 I Abstract Objective: To construct recombinant adenovirus vector of CEA promotor controlling the VP3 gene’s expression, and to investigate the targetting effects of the recombinant adenvirus vector on the human colon carcinoma cell. Methods: The pCEA and VP3-PolyA genes were obtained through PCR amplification, and connected to pCEA-VP3-PolyA (to call it CVP for short) by overlapping PCR. The CVP gene was cloned into adenovirus shuttle plasmid pAdtrack, then the resultant plasmid pAdtrack-CVP was cotransformed into E.coli BJ5183 bacterium with adenoviru