非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立.pdfVIP

动物医学进展 ，2013，34(1)：I-6 ProgressinVeterinaryM edicine 研究论文 ％ 非洲猪瘟病毒 VP73蛋 白在昆虫细胞 中的表达 与间接 ELISA方法的建立 曾少灵 。，廖立珊 ，唐金明 ，杨俊兴 ，阮周曦 ，张彩虹 ， 曹琛福 ，吕建强h，秦智锋 。，林庆燕 ，孙 洁 ，叶弈优 ，谢晓露 ，花群义 (1．深圳 出入境检验检疫局动植物检验检疫技术 中心，广东深圳 518045； 2．深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东深圳 518045) 摘 要 ：为了建立检测非洲猪瘟病毒 (ASFV)间接酶联免疫吸附试验 (iELISA)，利用杆状病毒表达载体 pFastBacHTA在 昆虫细胞 Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋 白，SDS—PAGE和 Westernblot检测显示 重组蛋 白大小约 65ku，能与 ASFV标准阳性血清发生特异性结合 。以此重组蛋 白作为检测抗原包被酶标 板 ，初步建立 了检测 ASFV血清抗体的 iELISA方法。表达的重组蛋 白具有 良好 的特异性 ，为制备 ASFV 免疫血清学诊断检测试剂和疫苗提供 了材料 。 关键词 ：非洲猪瘟病毒 ；VP73蛋白；间接 ELISA 中图分类号：$852．651；Q786 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2013)oi一0001—06 非洲猪瘟 (Africanswinefever，ASF)是由非洲 体产生中和抗体，且抗原性极为稳定，目前常被用作 猪瘟病毒 (Africanswinefevervirus，ASFV)引起 的 ELISA和 Westernblot检测 ASFV血清抗体 的主 猪的一种急性、高度接触传染性疾病。ASFV是一 要抗原_1]。我国 目前未发现 ASF，作为防控监测使 种虫媒性 DNA病毒 ，仅有一个血清型，但有多个毒 用 的商业检测试剂盒基本上需从 国外 引进 ，检测技 力差别 的病毒株_1]。非洲猪瘟 临床症状是高热、皮 术依赖 国外 ，检测成本 昂贵 ，试剂购置周期长，一定 肤发绀 、内脏器官严重出血 、呼吸障碍、神经症状 ，病 程度上限制了我国监测 ASF的力度和效果 。本研 程短 ，病死率高 ，对养猪业危害很大 ，可造成毁灭性 究在昆虫细胞 中实现了VP73蛋 白的真核表达 ，获 的严重后果，受到世界各 国的高度重视_1]。世界动 得了免疫原性 良好的重组蛋 白，为 ASF的免疫血清 物卫生组织 (OIE)将其列为必须报告的动物疫病 ， 学诊断试剂制备及监测技术储备奠定了基础。 在我国则列为一类动物疫病L2j。 l 材料与方法 1921年 ，ASF在肯尼亚被首次发现，此后在非 1．1 材料 洲 、欧洲和美洲等地 的数 10个 国家发生和流行 ，由 1．1．1 菌株与质粒 大肠埃希菌(E．coli)DH5a、 于非洲国家部分地 区的社会动乱和缺少疫病上报制 DH10Bac和载体 pFastBacHTA、pFastBacHT— 度 ，目前 ASF流行的实际状况 比上报的信息可能要 CAT均为 Invitrogen公司产 品；载体 pMD18-T为 严重得多口_3l1。OIE疫情 公告 中，俄罗斯 自2011年 宝生物工程 (大连)有限公司产品；质粒 pBAD-VP73 以来几乎每个月均有暴发 ASF疫情 ，每次暴发均导 (含 ASFV全长 VP73基 因，大小 1188bp)和昆虫 致上万头猪死亡或被扑杀 ，对猪养殖业造成 了重大 细胞 Sf9均为深圳 出入境检验检疫局动植物检验检 损失_4]，同时对包括我国在内的与其接壤的周边 国 疫技术中心动物检疫实验室保存 。 家和地区构成了严重威胁 ，对我国防控 ASF的传人 1．1．2 试剂 非洲猪瘟病毒标准 阳性血清、标准阴 敲响了警钟[6]。 性血清由英国动物卫生研究所(IAH)Pribright实验 ASFVVP73基 因全长 1188bp，编码的VP