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实验二十五 细胞中糖类化合物的提取及成分鉴定 糖类是一类多羟基的醛或酮及其缩合物或衍生物的总称，可分为单糖、寡糖、多糖、复 合糖及糖的衍生物如糖胺、糖酸等。糖类是生物界分布极广，含量十分丰富的一类有机化合 物，几乎所有的动物、植物、微生物体内都含有糖类，其功能也是多样的。过去认为糖类在 生物体内的作用主要是作为能量来源及结构物质，但近 20 年以来发现糖的复合物在细胞识 别、细胞间物质的运输和免疫调节等方面有重要的作用。糖复合物的信息量非常大，是生物 的另一类重要生物大分子化合物。因此糖的分离、纯化、结构测定、结构与功能的研究也受 到科学家广泛的关注。 糖的提取分离方法很多，主要是依据不同糖分子的物理化学性质、溶解度的差异进行 分离提取。近年也发展了许多新的分离、纯化方法，如薄层层析法、各种柱层析法、气相色 谱及高效液相色谱法等。 糖的定量分析方法也很多，有化学计量法如次亚碘酸法和非化学计量法如铜试剂法、 硝基试剂法等方法可供选择。 本实验主要介绍单糖、蔗糖及淀粉的分离提取、鉴定和测定的一般原理和方法。 实验原理 1．单糖及多糖的提取 单糖：凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广 泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的 水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机 溶剂中。而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。因此单糖和双糖一般可用热水或乙醇将之 提取出来。 多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。在自然界中分子结构复杂而多种 多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物 质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有更复杂的生理功能，在动植物的生理活动中起重要作 用。多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。因此可以用乙醇提取 单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。样品中的蛋白质、色素等杂质可通过加入醋酸铅、氢 氧化钡、铁氰化钾等清洁剂将之除去。 2．单糖和寡糖的测定——Somogyi-Nelson 法 单糖具有还原性，可将铜试剂还原生成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与钼酸盐生成蓝色化 合物，可在 560nm 下测出其光密度值，在一定浓度范围其光密度值与糖浓度呈比例关系。 其反应如下： 2+ 2Cu +还原糖→Cu 0 2 + Cu O+H S0 →2Cu 2 2 4 + 2- 2- + 2Cu +MoO +SO →2Cu2 +蓝色化合物 4 4 3．硫酸一酚法测定糖含量 糖类物质与硫酸作用脱水，生成糖醛酸或糖醛酸衍生物。糖醛酸及其衍生物可与苯酚反 应，生成有色的物质，己糖在 490 nm 处，戊糖及糖醛酸在 480nm 处有最大吸收，吸收值与 糖含量呈线性关系。 4．淀粉的测定 淀粉是由葡萄糖通过α (1→4)糖苷键及α (1→6)糖苷键连接而成的大分子化合物(支链 淀粉)，一般需要酸或淀粉酶将之水解为葡萄糖后，测定其葡萄糖含量，根据葡萄糖含量再 换算为淀粉含量，其水解方程式如下： (C H 0 ) +nH 0 一n(C H 0 ) 6 10 5 n 2 6 12 6 因其水解时一个葡萄糖单位增加了一个 H2O 分子，故从葡萄糖含量换算为淀粉含量时，需乘 上 0．9 的换算系数。 5．纸层析及薄层层析法分离、鉴定及定量测定糖类组分 在某些样品中或提取液中，糖的组分较为复杂，常常是一些单糖、寡糖的混合物。为了 进一步了解样品中糖的组成及含量，常可通过色谱法进一步分离、鉴定及定量测定其组成。 在糖的色谱分析中纸层析及薄层层析法由于其操作简便、快速，不需特殊分析设备而被广泛 应用。 (1)纸层析法 纸层析是属于分配层析的范畴，其原理主要是各组分之间的分配系数存在差异。纸层析 是以滤纸为支持物，滤纸的纤维素与水牢固结合而形成固定相，与