红笛鲷CD40基因克隆、表达及功能分析.pdf

红笛鲷CD40 基因克隆、表达及功能分析 摘 要 红笛鲷 （Lutjanus sanguineus ）是我国及东南亚重要的海水经济鱼类，食用价值 和经济价值极高。近年来，随着养殖密度的增加及养殖水体的恶化，导致多种病原菌 的爆发，对红笛鲷养殖业造成了巨大的经济损失。CD40 分子是肿瘤坏死因子受体 （tumor necrosis factor receptor, TNFR ）超家族成员，属于I 型跨膜糖蛋白。CD40 分 子在B 细胞的活化、分化、Ig 的分泌及类型转换，T 细胞的激发、定向分化，抗原呈 递细胞的激发、分化及功能调节，以及参与信号传导等方面起关键作用。而CD40 分 子执行生物学效应的前提条件是，通过CD40 与CD40 配体（CD40L ）结合后组成的 共刺激途径来影响免疫应答。CD40 与 CD40L 是体内炎症和免疫反应系统的一对共 刺激因子，参与机体内的体液和细胞免疫反应。目前，对CD40 基因在免疫系统应答 中的作用研究主要集中在哺乳动物，在硬骨鱼中极为鲜见。为了研究外界病原菌感染 红笛鲷过程中，CD40 基因在宿主免疫应答系统中的作用机制，我们开展了红笛鲷非 特异性免疫基因CD40 的分子克隆、表达特征及功能研究。 1. 通过同源克隆及RACE 技术，从红笛鲷头肾组织中成功克隆了CD40 基因的 cDNA 全长，通过生物信息学软件分析，结果表明，红笛鲷CD40 cDNA 序列由2073 个核苷酸组成，完整开放阅读框（ORF ）为984 bp ，5‟非编码区 （5‟-UTR ）为69 bp ， 3‟非编码区 （3‟-UTR ）为1020 bp ，编码327 个氨基酸，预测分子量 （MW ）为36.28 KDa ，理论等电点 （pI ）为5.38 。N 端有30 aa 的信号肽序列，在200-222 aa 位置存 在跨膜结构域。红笛鲷CD40 基因比较保守，具有TNFR 家族成员共有的半胱氨酸富 含域。构建系统进化树分析显示：红笛鲷与点带石斑鱼 （Epinephelus malabaricus ） 的亲缘关系较近。 2. 利用半定量RT-PCR 技术对红笛鲷CD40 基因的组织分布状况进行分析，结果 显示，CD40 基因在红笛鲷各组织中均有表达，其中在脾脏、头肾、肝脏、鳃、脑、 心脏、胃中表达量较高，而胸腺、肌肉、肠、皮肤中表达量较少。应用Real-Time PCR 检测在哈维氏弧菌（Vibrio harveyi ）、poly I:C 、LPS 分别刺激红笛鲷和红笛鲷头肾细 胞后，不同时间内CD40 基因的表达变化。结果显示，红笛鲷分别经哈维氏弧菌、poly I:C 刺激后，CD40 在头肾、胸腺、脾脏、肝脏、肠、鳃、肌肉组织中的表达量均上 调且表达模式相似。0~84 h 内，随免疫时间的延长，CD40 基因的表达量在上述组织 中达到峰值的时间不同。Poly I:C、LPS 刺激红笛鲷头肾白细胞后，结果显示，CD40 基因在细胞中表达量上调，在孵育细胞12 h 后达到峰值，且经LPS 孵育后CD40 的 表达量高于poly I:C 的孵育结果。 3. 构建原核表达重组质粒pET32-CD40、pET32-△CD40 和pET32-△△CD40， 分别表达CD40 基因全长cDNA、去信号肽基因cDNA 片段和胞外段基因cDNA 片段， I 通过优化表达体系，三个重组融合蛋白的最优表达条件分别是：37 ℃下，0.08 . -1 . -1 mmol L IPTG ，OD600=0.4 ，诱导5 h ；37 ℃下，0. 1 mmol L IPTG ，OD600=0.6 ，诱 . -1 导6 h ；37 ℃下，0.06 mmol L IPTG ，OD600=0.6 ，诱导6 h 。均以包涵体形式存在。 对pET32-△△CD40 重组蛋白进行纯化，Western blot 分析发现CD40 胞外段融合蛋 白能够与鼠抗His-Tag 单克隆抗体发