多胺化壳聚糖载体固定化漆酶及其性质研究.pdfVIP

. . 河南师范大学学报 自然科学版 第 卷 第 期 . 年 月 文章编号: 一? ?多胺化壳聚糖载体固定化漆酶及其性质研究 周 雪,朱启忠 山东大学威海分校 海洋学院,山东威海 摘 要:以多胺化壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂固定化白毒鹅膏菌漆酶,研究了最佳固定化条件及固定化酶 的部分性质.结果表明,戊二醛浓度 ,交联时间 ,固定化时间 ,给酶量 / 载体时固定化效果最佳,酶 活力可达 . / .此固定化漆酶的 为. 。;最适 值 . ,较自由漆酶向酸性偏移;最适反应温 度为 ℃,较游离漆酶热稳定性大大提高. 关键词:多胺化壳聚糖;固定化;漆酶 中图分类号: 文献标志码: 漆酶 ,. . . 即多酚氧化酶,它能利用分子氧作为氧化剂,氧化木质素中酚型单元,同时 还原分子氧生成水.在, ’一连氮基一双一 一乙基苯并二氢噻唑啉一 一磺酸 存在时,还能氧化 木质素中的非酚型单元,并且其催化过程不需要 参与,因此它在催化木质素降解时有一定的优越 性 .同时真菌漆酶也在废水处理 、造纸、饮料加工等众多工业领域具有巨大的应用潜力.但游离酶存在容 易变性失活,难以从反应体系中分离,重复使用率低等缺点,在很大程度上限制了漆酶的工业化应用.酶固定 化技术的发展提高了酶稳定性和重复使用率.目前,以多胺化壳聚糖为载体的报道仅限于木瓜蛋白酶和假丝 酵母菌体的固定,还未见用于漆酶固定化的报道.本文将壳聚糖上接枝亲水性多胺,以高机械强度的多胺化 壳聚糖微球对真菌漆酶进行了固定,探讨了固定化的最适条件,并获得了较好的固定化效果. 材料和方法 。 材 料 . . 菌种 白毒鹅膏菌,由本实验室自行分离得到。 . . 主要试剂及仪器 壳聚糖目,脱乙酰度为 .、环氧氯丙烷、四乙烯五胺、戊二醛 等, 所用试剂均为分析纯.紫外分光光度计. . 方 法 . . 培养基 固体培养基:培养基;产酶培养基:培养基. . . 培养方法三角瓶中装液体培养基 ,接人 ~ 日龄平板菌种 片/, ℃,恒温震荡培养. . . 粗酶液制备 培养的液体培养基,离心 , / , ℃ ,收集上清液,加入至 饱和度,充分混合后 ℃静置过夜,离心 , / , ℃ ,收集沉淀溶于 乙酸钠缓冲液. 中, ℃保存备用. . . 壳聚糖微球制备参照文献 并稍作改进,取 壳聚糖,加入质量分数 %的乙酸溶液中,配成质 量分数 的壳聚糖溶液,加入少量聚乙二醇和占溶液总体积的 %的无水乙醇,将混合液注入 %的 溶液中,静置 ,无水乙醇洗涤,干燥,得壳聚糖微球 . . . 多胺化壳聚糖载体制备 取,加入 甲醇,冰浴中滴加苯甲醛 , ℃反应 ,充 收稿日期:? ‘ 作者简介:周 一 ,女,河北唐山人,山东大学硕士研究生,研究方向:酶工程 河南师范大学学报 自然科学版 分洗涤,干燥,得壳聚糖苯甲醛 碱 .参照文献并稍作改进,取 微球浸泡在. / 溶液中,快速加入环氧氯丙烷 , ℃反应 ,充分洗涤,后将其缓慢加入乙醇和四乙烯五胺的混合液中,最后加入少量 水溶液, ℃反应 ,充分洗涤后加入 盐酸 . / 和 无水乙醇的混合液,搅拌 脱去苯甲醛,充分洗涤,干燥,得多胺化壳聚糖载 体 . . . 漆酶的固定化 取 . 加人 戊二醛溶液, ℃交联 ,用蒸馏水充分洗涤.将载体 放入 的? 缓冲液 . 中,加入 蛋白浓度 ./的粗酶液,室温下固定 ,用蒸馏水充分洗涤至无蛋白检出,用分光光度法检测酶活力. . . 酶活力测定 游离酶活力测定 ,每分钟吸光值改变量的倍定义为 个酶活单位 ;固定化 酶活力测定:取 . 固定化漆酶,加入的乙酸钠缓冲溶液 含 .愈创木 酚 ,室温下反应 ,离心,取上清液于 . 处测吸光度;固定化酶比活力 / :::固定酶的总活力/ 固定化酶的干质量. . . 蛋白质浓度测定 考马斯亮蓝法 . 结果与讨论 . 固定化漆酶最适条件选择 . . 戊二醛浓度对固定化效果的影响取 .份,分别加入浓度为 ~ 的戊二醛溶液,按前 述方法固定化漆酶,测定固定化漆酶活力,结果见图 .固定化漆酶酶活力在戊二醛浓度为 时达到最高, 继续增大戊二醛浓度,固定化漆酶酶活力下降.戊二醛通过与壳聚糖分子中的氨基反应形成活性结构,戊二 醛浓度过大会消耗大量氨基,降低载体与酶的结合能力,同时戊二醛又可使酶变性失活,因此戊二醛浓度是 影响固定化效果的关键因素. . . 交联时间对固定化效果的影响 取 .份 加人浓度为 的戊二醛溶液 , ℃分 别交联 ~,按前述方法固定化漆酶,测定固定化漆酶活性,结果见图 .随着戊二醛交联时间延长,固定 化酶活力先增大后减小,交联时间为时达到最大值.戊二醛具有双功能基团,其一侧醛基与壳聚糖载体 上的氨基产生偶联反应