小麦ERF类转录因子W17的结合特异性及亚细胞定位分析.pdfVIP

中国农业科学 2008,41(6):1575-1582 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.06.002 小麦ERF类转录因子W17的结合特异性及亚细胞定位分析 1，2 2 2 2 1 2 2 2 赵云祥 ，徐兆师 ，陈 明 ，李连城 ，陈耀锋 ，邱志刚 ，熊祥进 ，马有志 1 2 （西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100 ； 中国农业科学院作物科学研究所/ 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程/ 农业部作物遗传育种重点开放实验室，北京 100081 ） 摘要： 【目的】构建 ERF（ethylene-responsive element binding factor）转录因子基因 W17 的亚细胞定 位载体和原核表达载体，验证W17是否具有核定位功能，阐明W17 与GCC、DRE探针的体外结合特性，利用GUS瞬 时表达系统分析W17蛋白的体内结合特性和转录激活功能，初步预测W17在植物胁迫信号传导途径中的作用。【方 法】构建 W17/163hGFP 亚细胞定位载体，基因枪转化洋葱表皮细胞，暗培养 24 h 后共聚焦显微镜下观察。构建 W17/pGEX-4T-1原核表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3），IPTG（0.5 mmol·L-1 ，3 h）诱导，GST纯化柱纯化，纯 化的融合蛋白与[γ-32P]ATP 标记的 GCC、DRE 探针混合进行凝胶阻滞试验。构建 GUS 瞬时表达系统，通过农杆菌介 导转化烟草，X-Gluc 染色、酒精脱色后体视显微镜下观察。【结果】W17 基因具有核定位功能，纯化的融合蛋 白GST/W17 能与正常GCC、DRE探针体外特异结合，与突变GCC、DRE探针不结合，在植物体内与GCC特异结合并 能激活下游GUS基因表达。【结论】W17通过自身的NLS进入核内行使功能，参与了GCC-box 调控的生物胁迫信 号传导途径，还可能参与了非生物胁迫（盐胁迫）传导途径。 关键词：ERF/AP2结构域；ERF；DRE元件；GCC-box；亚细胞定位；小麦 Analysis of Specific Binding and Subcellular Localization of Wheat ERF Transcription Factor W17 1,2 2 2 2 1 2 ZHAO Yun-xiang , XU Zhao-shi , CHEN Ming , LI Lian-cheng , CHEN Yao-feng , QIU Zhi-gang , 2 2 XIONG Xiang-jin , MA You-zhi 1 2 ( Agronomy College, Northwest Sci- Tech University of Agriculture and Forestry,