酶促反应制备壳寡糖及壳寡糖分析.pdfVIP

维普资讯 酶促反应制备壳寡糖及壳寡糖分析 杨菊林 ，韩宝芹，刘万顺 (中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003) 摘要 ：用壳聚糖酶降解法对壳聚糖进行 降解制备壳低 聚糖 ，研 究 了温度 、pH、底物浓度 、脱 乙酰度 、反应 时间 对酶促反应的影响。对酶解产物进行 HPLC分析 ，用 Bio—GelP4柱对酶解产物进行初步分 离。结果表 明， 壳聚糖酶降解壳聚糖的最适温度为 45℃，pH 为 6．0，最适底物质量分数为 6 ，脱 乙酰度越高酶解反应所得 产物 的数均相对分子质量越小，24h后酶解反应达到平衡 ，酶解产物壳寡糖水溶性极好 。P一4柱分 离得到聚 合度 2O以上 ，1O～20，10以下3种壳寡糖 。 关键词 ：壳聚糖酶 ；壳寡糖；分析 中图分类号 ：Q814．9；Q556．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3096(2008)06—000504 壳聚糖是 由乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc)和氨基 1．2．2 还原糖浓度及壳寡糖分子量测定 葡萄糖 (GlcN)通过 J3—1，4键连接而成的天然线性高 DNS法 测定 ]，分 别取 出0．2mL酶解 液加 入 聚物 ，由于其相对分子质量大 ，水溶性差 ，在人体 内 1．8mL蒸馏水和 1．5mIDNS，沸水浴反应 5rain显 不易被吸收，从而使其应用受到 限制。壳聚糖 的低 色 ，定容至 25mL，于 520nm测吸光度A 。。值 ，还原 聚物有优越 的水溶性 、保湿性 ，同时具有抗细菌 、真 糖浓度与光密度值成正比。 菌 ，调节机体免疫及抗癌等功能_1]，越来越受到关 将酶解后的壳寡糖样品充分干燥后采用乙酰丙 注 。目前制备可溶性壳寡糖主要有 4种方法 ：酸解 酮法进行分子量测定_7]。 法、酶解法 、碱解法和氧化降解法。其中，酸、碱降解 1．2．3 最适酶反应温度的测定 法存在酸碱性过强 、降解速度慢 、降解产物 聚合度 分别将壳聚糖酶液 0．1mL(9．08U／mL)与 5 小、产物纯化难等缺 点，而酶解法 以条件温和、产率 的壳聚糖醋酸溶液 5mL于 35，40，45，50，55，60℃ 高、反应易控制及所得低聚物聚合度适 中等优点而 保温 3h后 ，分别测定各温度下的还原糖浓度 。 倍受青睐 ’。本实验室通过发酵得到高酶活壳聚 1．2．4 最适酶反应 pH的测定 糖酶，利用此酶降解壳聚糖 ，对降解条件进行探索， 在 pH 分别为 4．6，5．0，5．4，5．6，6．0，6．4的 并对酶解产物进行初步分离纯化分析。 0．2mol／LHAc—NaAc缓冲液 中，将壳聚糖酶液与 底物按 1．2．3中比混合，45℃下反应 3h，分别测定 1 材料与方法 各 pH下的还原糖浓度。 1．2．5 最适酶反应底物浓度的测定 1．1 实验材料 分别将壳聚糖用醋酸溶液配成质量分数为 2 ， 壳聚糖 (脱乙酰度 90 ，购于青岛海汇生物工程 4 ，6 ，8 ，10 的溶液 ，凋 pH 为 6．0，分别取上 公司)，壳聚糖酶 (本实验室发酵制备)，色谱柱 (KS- 述壳聚糖溶液 5mL，加入 0．1mL(9．08U／mL)壳 801柱)，层析树脂 (Bio～GelP一4