人脂联素原核表达纯化及活性检测.pdfVIP

动物医学进展 。201l，32(10)：36—39 Progressin VeterinaryMedicine 人脂联素原核表达纯化及活性检测 王云龙 ，李永超 ，昌静峰。，李玉林。，王国强。，邓黎黎。，陈冬焕。，董彩文。，孙新城。，刘旺根。，梁晓艳。 (1．河南工业大学 ．河南郑州 450001；2．郑州职业技术学院，河南郑州 450121； 3．河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001) 摘 要：为 了克隆人脂联素基 因(ACRP30)，获得有免疫活性 的重组人脂联素，以人皮下脂肪组织为材 料 ，提取总 RNA，通过 RT—PCR得到ACRP30基 因。构建重组质粒 pET-CKS—ACRP30，转化表达茵 BL21 (DE3)，以 IPTG诱导表达人脂联素重组蛋 白，利用镍亲和层析纯化 ，Westernblot鉴定其活性 ，双抗体夹心 法检测其免疫活性。获得 了人脂联素基 因，表达纯化 了人脂联素融合蛋 白，融合蛋 白分子质量约为 5Oku， 表达量约 占茵体总蛋白的30 ，纯度达到 90 ，双抗体夹心法检测重组蛋 白具有免疫活性。本研究成功表 达 了人脂联素重组蛋白且表达产物具有免疫活性 ，为人脂联素检测技术的建立奠定 了基础 。 关键词 ：人脂联素 ；原核表达；免疫活性 中图分类号：Q789 文献标识码 ：A 文章编号：1oo7—5O38(2O11)10—0036—04 脂联素 (adiponectin)是 由脂肪细胞分泌 的一种 剂盒 、DNA回收试剂盒 、Taq酶等 由河南省生物工 细胞 因子 ，具有抗动脉粥样硬化 、调节脂肪酸氧化和 程技术研究中心提供 ；限制性 内切酶 、T4连接酶等 糖代谢、增加胰岛素敏感性、抑制肝糖产生、抑制反 为宝生物工程 (大连)有 限公司产品；脂联素标准品 馈 TNF-e的生成与释放，对损伤的肝细胞有重要的 为惠安生物科技有限公司产品；人脂联素抗体 、人脂 保护 ‘。 联素酶标抗体为 RDsystem公司产品。 脂联素是 由244个氨基酸组成 的胶原样蛋 白， PCR引物由上海博 尚生物技术有限公司合成 。 分子质量为30ku，故其基因又命名为 ACRP30(adi— 上游引物 ：5一CGGGATCCGCTAGCATGCTGT— pocytecomplement—relatedproteinof30ku)[。人 TGCTGGGAGCTGTT一3，下戈线分另0为BamH I 脂联素基因位于染色体 3q27，全长约 17kb，由3个 和 NheI酶切位点；下游 引物 ：5，-CGGAATTC 外显子和 2个内含子组成[5]。研究发现肥胖者和 Ⅱ CTCGAG GTTGGTGTCATGGTAGAGAAGAA 一 型糖尿病患者血浆脂联素水平 明显 降低 ，说 明脂联 3，下划线分别为 EcoRI和 XhoI酶切位点。 素与肥胖 、胰 岛素抵抗和 Ⅱ型糖尿病有着密切联系， 1．2 方法 具有潜在的降糖 、抗动脉粥样硬化 以及抗炎效应[6]。 1．2．1 总RNA 的提取及 RT—PCR 将人新鲜脂肪 本研究 以人脂肪组织为材料通过 RT-PCR扩 组织约 200mg加入少量液氮充分碾磨均匀 ，提取总 增 出ACRP30全长片段 ，将 ACRP30基 因与表达载 RNA，置～20℃保存[。取 2 L总 RNA用 RT— 体 pET—CKS连接，构建重组质粒 pET—CKS-AC- PCR试剂盒反转录、扩增 ，PCR循环参数为 ：94℃预 RP30转化大肠埃希菌表达 。载体 pET—CKS含有 变性 5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ lmin，30 His标签 ，为 ACRP30重组蛋 白的纯化提供 了条件 。 个循环 ；72℃ 5min。15g／L琼脂糖 电泳 ，按 照 对表达的重组蛋 白免疫活性进行检测 ，为进一步开 DNA 回收试剂盒说明回收 PCR产物 。 发应用奠定基础。 1．2．2 pET—CKS—ACRP30