重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立.pdfVIP

浙江农业学报 ActaAgriculturaeZhejiangensis20(6)：408～413，2008 重组 NP蛋白抗原检测 SIV抗体 间接 ELISA方法的建立 王方 昆，一，袁秀芳 ，刘思当 ，张 存 ，徐丽华 ，王一成 ， (浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021；山东农业大学动科院，山东泰安 272018) 摘 要 ：用纯化的H9N2亚型猪流感可溶重组NP蛋白作为包被抗原，建立了检测猪流感抗体的间接 ELISA方 法。ELISA的最佳工作条件是 ：抗原包被浓度为 12．5tcCmL，37％1h，4℃过夜；血清稀释度为 1：40；酶标 SPA 稀释度为 1：10000，37℃温育40 min，底物显色37℃ 15min。经重复性试验、交叉试验 、竞争抑制试验等试 验 ，结果表明该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用TG-ROC软件确定了自制 ELISA(NP-ELISA)酶标板 的临界值为0．20，特异性和敏感性分别为95．83％和91．43％。与美 国 IDEXX试剂盒相 比较，符合率为 94．0o％，无显著性差异。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份，总阳性率为35．4D|％。 关键词：猪流感；重组 NP蛋白；ELISA 中图分类号：S828 文献标识码 ：A 文章编号：1004一l524(2008)06—0408—06 AnindirectELISAmethodbasedonrecombinantnucleoprotein(NP)fordetectionof natibodiestoswineinfluenzavirus(SⅣ ) WANG Fang．kun’，YUAN Xiu．fnag，L1U Si—dang2ZHANG Cun XU Li—hua，WANG Yi．cheng ， (InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，Zhejia~AcademyofAgriculturalSceinces，Hangzhou310021，Chi— M ；CollegeofAnimalScienceand VeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tat’ 271018，China) Abstract：ThesolubleSIVrecombinantnueleoprotein(NP)wasexpressedbyEscherichia．coliandpurifiedthroughnative conditionspurificationmethod．Usingpurifiedsolublenucleoprotein，anindirectELISA fordetectionofanti·SIV antibodies Was developedanditsoptimalreactionconditionsweredetermined：coatingnatigenconcentrationWas12．5eg／m1．at37cc for1hnad4℃overnight，senlnlsamplesweredilutedto1：40，Pemxidase—LabeledSPA(1：100o0)Wasincubatedat37oC f0r40 min．thesubstrateofrshowingcolorwasincubatedat37℃ f0r15min．Th eELISA assaywasconfirmedtohavea good，specificityandsensitivitybyrepeatability，Crosstestnadcompetitive—inhibitiOiltest．ThecriticalOD valllesforthe ELISAWas 0．20，whichWas determinedbyusingtheTwoGraph—ROCfunctions oftheCMDTosftw~epackage，naditWas ofundthatthespecificitynadsensitivityoftheEL