ROX参比荧光在实时荧光定量RT—PCR检测Nrf2 mRNA中的应用.pdfVIP

中华检验医学杂志 2011年 8月第34卷第 8期 ChinJLabMed．August20Il，vI‘．34，Nt．8 ． 实 验 室 质 量 管理 ． ROX参 比荧光在实时荧光定量 RT—PCR 检测 Nrf2mRNA中的应用 高峰 杨学文 王佳 张春兵 摘【要】 目的 建立大鼠Nrf2mRNA实时荧光定量RT—PCR检测方法，评价ROX参比荧光在其 分析中的归一化校正作用。方法 采用TaqMan探针法构建大鼠Nrf2mRNA实时荧光定量RT—PCR 检测方法；取大鼠混合 eDNA的Nrf2PCR产物，经凝胶电泳和测序鉴定反应特异性；取 PCR标准品 1O个浓度梯度 (2．0x10～2．0x10)各 1份进行实时荧光定量RT—PCR检测 ，分析 ROX参 比荧光校 正与否的标准曲线的线性范围的变化；取高、中、低值重组质粒样本各 1份进行批内重复20次和批问 连续20次实时荧光定量RT．PCR检测，分析ROX参比荧光校正与否的批内、批间重复性差异。结果 成功建立大鼠Nrf2mRNA实时荧光定量 RT．PCR检测方法 ；大鼠混合cDNA的Nrf2PCR扩增片段与 预期 122bp相符，测序结果扩增片段序列正确 ，PCR特异性好；标准品PCR扩增结果的标准曲线线性 范围未经 ROX参 比荧光校正为 2．0×10 ～2．0×10 拷 贝／l(R 0．99)，校正后为 2．0×10 ～ 2．0x10。拷贝／l(R 0．99)，校正后线性范围变宽 100倍。高、中、低值样本重复性分析结果显示 未经ROX参 比荧光校正批内ct变异系数 (CV)为4．1％、2．7％、2．1％，批间 CV为4．3％、3．O％、 2．4％，校正后批 内CV为0．7％、0．5％、0．4％，批间CV为 1．0％、0．8％、0．7％，ROX参比荧光校正后 样本ct离散程度均低于未校正组，批内、批间的高值、中值浓度样本 (高值组批内和批问t值分别为 4．843、2．566，中值组批内和批问t值分别为4．293、4．423，P均0．05)，但低浓度组的Ct离散度的差 异无统计学意义(低值组批内和批间t值分别为0．753、1．279，P均0．05)。结论 在构建大鼠Nrf2 实时荧光定量RT—PCR检测方法中，加入ROX参比荧光，可加宽PCR标准曲线的线性范围，提高检测 重复性，为准确分析大鼠模型Nrf2mRNA表达水平奠定了基础。 【关键词】 NF—E2相关因子2；逆转录聚合酶链反应；琥珀酰亚胺类；若丹明类 Investigation on the influence of the ROX reference fluorescence correction on the rea1．time quantitativeR1-PcRassessmentforNrf2utRNA GAo Feng，YANGXue—wen，WANGJia．zHANG Chun—bing．DepartmentofLaboratoryMedicineofJiangsuProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine， Nan]ing210029． ina Correspondingauthor：ZHANGChun—bing，EmaiZ：zhang chb99@ yahoo．COHLcn _ 【Abstract】 objective Toevaluatethenormalized correction effectoftheROX reference fluorescenceonthereal—timequantitativeRT—PCR assessmentfortheNrf2mRNA．M ethods TheTaq—man probewasutilized in thereal—timequantitativeRT．PCR methodtoassesstheNrf2 mRNA：Thereaction specificityoftheNrf2PCRproductsobtainedfrom therateDNA wasassessedusinggelelectrophoresisand s