DG-DGGE在基因多样性快速检测中的研究.pdfVIP

一 56一 江苏农业科学 2011年第39卷第4期 刘 双，刘 丹，凌 云．DG—DGGE在基因多样性快速检测中的研究[J]，江苏农业科学，2011，39(4)：56—58 DG—DGGE在基因多样性快速检测中的研究 刘 双 ，刘 丹，凌 云 (上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306) 摘要：为了探究双梯度变性凝胶 电泳技术 (DG—DGGE)相对于单一变性梯度凝胶 电泳技术 (DGGE)可以提高基 因多样性的检测效率。结合2种胶各 自特点，在相同的试验条件下对在相同变性剂梯度下，双变性梯度胶DG—DGGE 胶与单一变性梯度胶DGGE胶分离效果的比较，发现DG—DGGE胶的特点。之后在横向变性梯度条件下，进行 DG— DGGE胶与DGGE胶分离效果的比较 ，找出各 自的最适梯度。最后再把预测的DG—DGGE胶可以提高基因多样性的 检测效率结果在试验中进行了验证。结果表明，在各 自最适变性剂梯度下，DG—DGGE胶效果并不比DGGE胶的分 离效果差，同时可以将原来 DGGE检测所需的电泳时间缩短40％左右。 关键词：DG—DGGE；I)GGE；最适变性剂梯度 ；电泳时间；快速检测 中图分类号：Q786 文献标志码 ：A 文章编号 ：1002—1302(2011)04—0056—02 变性梯度凝胶电泳技术是 目前研究微生物群落遗传多样 在 geunePCR仪上进行，PCR扩增条件为-94℃预变性5rain； 性及种群动态性的有效手段，变性梯度凝胶电泳技术是 DNA 2O个循环的降落PCR(94℃ Irain，退火30s，72oC3rain；退 指纹技术 ，由 Fisheher等最先提 出并用于检测 13NA 的突 火温度由65℃降至55℃，每循环递减0．5 )；15个循环 变 。1993年 ，Muyzer等首次将该技术应用于微生物生态的 (94℃1mln，55℃退火30s，72℃3min)；72℃延伸l0m／n。 研究 。近 10年的时间里已被广泛应用于各种环境微生物 反应产物直接用于变性梯度凝胶 电泳 (DGGE)分析。 生态的研究，如生物膜、活性污泥、土壤、沙丘、根际、热泉、湖 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和双梯度 一变性梯度凝胶电 泊和海洋等 。现有的细菌 DNA多样性检测方法主要有 泳 (DG—DGGE)分析：采用Bio—Rad公司Dcod~MT的基因突 DGGE、TEEG、克隆等，以DCGE和克隆相关报道较多 。。 变检测系统对PCR反应产物进行分离分析。根据试验要求 国内外对DG—DGGE双梯度凝胶 电泳技术也有报道 ，但运 分别制备6％、8％和 10％的聚丙烯酰胺备用，选择适宜的变 用相对 比较少。笔者研究了DG—DGGE技术的双重梯度特 性剂浓度 (100％ 的变性剂为 7mol／L尿素和40％去离子 甲 点及其与DGGE的区别，并试图通过DG—DGCE对多样性的 酰胺的混合物)，按照Bio—Rad使用说明分别灌制横向变性 分析在较短的检测时问内达到较好的分离效果。 梯度胶和纵向变性梯度胶，并加 1cm左右 O％变性剂梯度的 堆积胶 。 1 材料与方法 根据试验需要调整 电压进行恒压 电泳，电泳结果用 EB 1．1 材料 染色并在紫外灯下观察摄像。通过 QuantityOne软件将 本试验采用的样品为阳澄湖湖区春季采的水样以及临港 DGGE图谱照片转化成数字信号进行分析。 水质净化厂的活性污泥样品，基因提取采用 申能博彩公司的 2 结果与分析 I(717环境样品提取试剂盒，具体操作方法见说明书。 1．2 方法 2．1 在相同变性剂梯度下，